SBC Scientific - POLYSACCHARID TỪ NẤM LINH CHI VÀNG CHỐNG OXY HÓA BẢO VỆ GAN

POLYSACCHARID TỪ NẤM LINH CHI VÀNG CHỐNG OXY HÓA BẢO VỆ GAN

Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh triterpenoid, polysaccharid là những nhóm hoạt chất quyết định dược tính của nấm linh chi. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết cồn và cao chiết nước từ nấm linh chi vàng (Ganoderma colossum) có hoạt tính chống oxy hóa in vitro, làm giảm sự tăng hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan bị gây tổn thương oxy hóa bởi cyclophosphamid.
facebook-sbc.png   wordpress-logo.png   twitter-16x16.png   youtube-16x16.png   google-plus-icon.png   pinterest-logo-16x16.png   blogger-16x16.png   google-sites.PNG  sbc-logo-16x16.jpg
nam-linh-chi.png

Trong bài viết này, khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trên thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa tế bào gan bằng cyclophosphamid.

Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu: Polysacharid thô được chiết bằng phương pháp đun hồi lưu bột nấm với nước (1:20) trong 6 giờ và tủa bằng cồn 96% (tỷ lệ 1:5). Nghiên cứu in vitro: Khảo sát hoạt tính dập tắt gốc tự do bằng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid bằng thử nghiệm MDA. Nghiên cứu in vivo: Polysaccharid thô được cho uống liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng. Vào ngày thứ 8, mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và glutathion (GSH).

Kết quả: Polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng có hoạt tính chống oxy hóa in vitro yếu. Ở liều uống 100 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày, polysaccharid làm giảm sự tăng hàm lượng MDA trong gan và phục hồi sự giảm hàm lượng GSH nội sinh trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid. Polysaccharid thô ở liều uống 50 mg/kg không làm thay đổi hàm lượng MDA và GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy liều này chưa thể hiện tác dụng trên sự thay đổi hàm lượng MDA hoặc hàm lượng GSH trong gan gây bởi cyclophosphamid.
 
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt động của hệ miễn dịch và có hiệu quả trị
liệu tốt cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh về gan. Các triterpenoid, polysaccharid đã được chứng minh là những nhóm hoạt chất quyết định dược tính của linh chi(3). Nấm linh chi vàng (Ganoderma colossum) là một trong lục bảo linh chi, tuy nhiên cho đến nay có rất ít báo cáo về tác dụng sinh học của loài nấm này. Kleinwatcher P. & cs. và El Dine R.S & cs. đã phân lập và xác định cấu trúc của các lanostan triterpen lacton (colossolacton I, II, III, IV) trong Ganoderma colossum của Việt Nam(5,6). Ngoài tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn và độc tế bào, các colossolacton còn có tác dụng kháng HIV và kháng virus gây viêm gan siêu vi C(4). Kết quả nghiên cứu gần đây của Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM cho thấy cao chiết cồn và cao chiết nước từ nấm linh chi vàng có tác dụng dập tắt gốc tự do và ức chế quá trình peroxy hóa màng tế bào, làm giảm sự tang hàm lượng MDA trong gan bị gây tổn Thương oxy hóa bởi cyclophosphamid(8). Tuy nhiên các nghiên cứu về polysaccharid chiết từ nấm linh chi vàng chưa được nghiên cứu. Do đó, đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của polysaccharid chiết từ nấm linh chi vàng Ganoderma colossum” được thực hiện với các mục tiêu sau:
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng bằng thử nghiệm 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) và thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA).
- Khảo sát tác dụng của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trên thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa ở gan chuột nhắt trắng bằng cyclophosphamid, thông qua chỉ tiêu xác định hàm lượng MDA và glutathione (GSH) trong gan.

Đối tượng nghiên cứu
Nấm linh chi vàng được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm Dược liệu. Polysacharid thô được chiết bằng phương phap đun hồi lưu bột nấm với nước (tỷ lệ 1:20) trong 6 giờ và tủa bằng cồn 96% (tỷ lệ 1:5). Hiệu suất chiết là 4,66%. Hàm lượng đường hòa tan là 47,39% và hàm lượng đường khử là 10,67%.

Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP. Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên, rau xanh và nước uống đầy đủ. Thể tích cho uống mẫu thử nghiệm hay tiêm phúc mạc cyclophosphamid là 10 ml/kg thể trọng chuột.

Thuốc thử nghiệm
Endoxan® chứa 534,5 mg cyclophosphamide monohydrat tương đương với 500 mg cyclophosphamid khan (Baxter Oncology GmbH, Germany). Lô sản xuất 9F615E, ngày sản xuất: 06/2009; hạn dùng 06/2012. Các thuốc
đối chiếu: Acid ascorbic (Sigma Co. Ldt, US); Trolox (Sigma Aldrich.); Silymarin (Sigma Co.Ltd, USA).

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu in vitro
Phương pháp xác định khả năng dập tắt gốc tự do (thử nghiệm DPPH)(2,8)
 0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được cho phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH 0,8 mM pha trong MeOH. Hỗn hợp sau khi pha được để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm. Acid ascorbic được sử dụng làm chất đối chiếu. Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA)(8,9) 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphat vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 100oC. Làm lạnh và đo quang ở bước sóng λ = 532 nm. Trolox, đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu.
Tính toán kết quả
Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa
(HTCO):
HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100
ODC: Mật độ quang của chứng dung môi
(DMSO hay MeOH).
ODT: Mật độ quang của mẫu thử.
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau.

Phương pháp nghiên cứu in vivo
Gây mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid(7,8)
Chuột thí nghiệm được chia thành hai nhóm:
- Nhóm bình thường, ký hiệu CY (-):
Lô chứng: uống nước cất.
Lô thử: uống polysaccharid thô được hòa tan trong nước cất liều 100 mg/kg thể trọng.
Lô thuốc đối chiếu: uống silymarin liều 100 mg/kg thể trọng.
- Nhóm bệnh lý, ký hiệu CY(+): chuột được tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamide 150 mg/kg thể trọng.
Lô chứng: uống nước cất.
Lô thử: uống polysaccharid thô được hòa tan trong nước cất liều 50 và 100 mg/kg thể trọng.
Lô thuốc đối chiếu: uống silymarin liều 100 mg/kg thể trọng.
Thời gian cho uống hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH.

Phương pháp xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột(8)

Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-5 0C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm vào 1 ml dung dịch đệm Tris (pH = 7,4). Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid
thiobarbituric 0,8 % ở 100 0C trong 15 phút và đo quang ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA.

Phương pháp xác định hàm lượng glutathion (GSH) trong gan chuột(7)

Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-5 0C. Lấy 1 ml dịch đồng thể gan và thêm đệm Tris (pH = 7,4) vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy 1 ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5’–dithiobis– (2–nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphat vđ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g protid) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH.

Đánh giá kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so với lô chứng.

KẾT QUẢ-THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu in vitro

Bảng 1. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trong thử nghiệm DPPH.

NỒNG ĐỘ µg/ml ΔODTrung bình HTCO%
Chứng 0,775 -
NỒNG ĐỘ µg/ml ΔODTrung bình HTCO%
2000 0,277 64,23
1500 0,370 52,23
1000 0,477 38,41
500 0,605 21,89
250 0,686 11,43
100 0,721 6,97
50 0,767 0,97
10 0,773 0,26
Bảng 2. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trong thử nghiệm MDA.

NỒNG ĐỘ 
µg/ml
ΔOD Trung bình HTCO%
Chứng 0,431 -
2000 0,161 62,72
1500 0,247 42,74
1000 0,286 33,57
500 0,318 26,13
250 0,338 21,60
100 0,359 16,61
50 0,390 9,41
10 0,404 6,27
Nhận xét và bàn luận

Trong thử nghiệm DPPH, DPPH là gốc tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi, nhưng sau khi phản ứng với oxy nguyên tử của chất dập tắt gốc tự do sẽ bị giảm màu tím. Hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH, dẫn đến giảm độ hấp thu ở bước sóng 515 nm. 
Trong thử nghiệm MDA, MDA là chất được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo ra phức hợp trimethin có màu hồng. Hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid thể hiện qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm lượng MDA có trong mẫu dẫn đến giảm độ hấp thu ở bước sóng 532 nm. 
Bảng kết quả 1 và 2 cho thấy, hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharid trong hai thử nghiệm DPPH và MDA ở nồng độ 2000 μg/ml là cao nhất, tuy nhiên hoạt tính này yếu khi so sánh với giá trị IC50 của các chất đối chiếu dương (bảng 3). 

Bảng 3. Giá trị IC50 của polysaccharid chiết từ nấm linh chi vàng
  IC50 (µg/ml)    
DPPH     MDA  
Polysaccharid   Acid ascorbic Polysaccharid   Trolox
1462,6   46,2 1603,2   860

Kết quả nghiên cứu in vivo

Bảng 4. Kết qu kho sát hàm lượng MDA trong gan  
Nhóm Lô (n = 10) Liều uống (mg/kg) Hàm lượng MDA 
(nM/ml dịch đồng thể)
Hàm lượng MDA  (nM/g Protid)
CY(-) Chứng   2,82 ± 0,18 76,90 ± 4,82
Polysaccharid 100 3,23 ± 0,13 88,22 ± 3,51
Silymarin 100 3,07 ± 0,21 83,90 ± 5,78
CY(+) Chứng   6,42 ± 0,42 175,58 ± 11,39#
Polysaccharid 50 6,13 ± 0,32 167,35 ± 8,70
100 4,22 ± 0,43 115,11 ± 11,82*
Silymarin 100 3,54 ± 0,34 96,70 ± 9,37*
CY(-) : Nhóm chuột bình thường, không tiêm cyclophosphamid; CY(+): Nhóm chuột bị gây stress oxy hóa, có tiêm cyclophosphamid; # P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY (-); * P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(+) tương ứng
Bảng 5. Kết qu kho sát hàm lượng GSH trong gan 
Nhóm Lô (n = 10) Liều uống (mg/kg) Hàm lượng GSH (nM/ml dịch đồng thể) Hàm lượng GSH (nM/g Protid)
 
CY(-)
 
Chứng   425,88 ± 10,85 11626,73 ± 296,28
Polysaccharid 100 414,98 ± 23,77 11329,20 ± 648,83
Silymarin 100 430,01 ± 20,15 11739,64 ± 550,13
 
CY(+)
 
 
Chứng   245,24 ± 13,0 6695,20 ± 354,81#
Polysaccharid
 
50 250,22 ± 16,74 6831,13 ± 457,10
100 332,17 ± 19,99 9068,51 ± 545,81*
Silymarin 100 361,28 ± 24,35 9863,33 ± 664,68*
CY(-) : Nhóm chuột bình thường, không tiêm cyclophosphamid; CY(+): Nhóm chuột bị gây stress oxy hóa, có tiêm cyclophosphamid; # P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(-) ; *P< 0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(+) tương ứng 

Nhận xét và bàn luận bảng kết quả 4 và 5 glutathion, chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý
Lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống ở ngày thứ 8 sau khi tiêm cyclophosphamid(7). nước cất trong 8 ngày có hàm lượng MDA tăng
 
Kết quả thực nghiệm của đề tài cũng ghi nhận đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình kết quả tương tự, cho thấy có sự giảm hàm thường, chứng tỏ cyclophosphamid gây tổn lượng  glutathion ởlô chứng tiêm thương peroxy hóa màng tế bào dẫn đến việc cyclophosphamid đạt ý nghĩa thống kê so với lô làm tăng hàm  lượng MDA trong gan. chứng sinh lý. Điều này cho thấy glutathion và Cyclophosphamid được biến đổi sinh học tại những nhóm chất có chứa sulfhydryl (như gan trở thành 4-hydroxycyclophosphamid và cystein và N-acetylcystein) với chức năng giải aldophosphamid có tính alkyl hóa, dẫn đến sự độc đã thông qua hệ thống cytocrom P-450 hình thành các tác nhân gây độc tế bào như Ngoài ra, nghiên tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của acrolein, chloroacetaldehyd cyclophosphamid trong cơ thể(1). Độc tính của cứu trước đây của nhóm cũng đã chứng minh cyclophosphamid tăng kéo theo sự suy giảm cyclophosphamid           làm        giảm      hàm       lượng glutathion nội sinh trong gan, do đó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào dẫn đến hàm lượng MDA tăng. 

Lô bình thường không tiêm cyclophosphamid và uống polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng trong 8 ngày có hàm lượng MDA và GSH không thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ polysaccharid không có tác dụng trên cơ thể chuột bình thường. Lô tiêm cyclophosphamid và uống polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng ở liều 50 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày không làm thay đổi hàm lượng MDA và GSH đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy liều này chưa thể hiện tác dụng trên sự thay đổi hàm lượng MDA hoặc hàm lượng GSH trong gan gây bởi cyclophosphamid.

Lô tiêm cyclophosphamid và uống polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng ở liều 100 mg/kg thể trọng chuột trong 8 ngày có tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA và làm tăng hàm lượng GSH trong gan đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, cho thấy polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng ở liều này thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid. Thuốc đối chiếu dương silymarin, hoạt chất được chiết xuất từ cây Silybum marianum (Cúc gai) cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid.

KẾT LUẬN 
Polysaccharid thô chiết từ nấm linh chi vàng có tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid.
Cám ơn: Nhóm tác giả ( Ngô Quốc Hận và Nguyễn Thị Thu Hương) xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.            Abraham P., Sugumar E. (2008). Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats
after a single dose of cyclophosphamide: a defense mechanism?. Exp. Toxicol. Pathol., 59(5):301-306.
2.            Amarowiez R., Pegg R.P., Rahimi-Moghaddam P., Barl B.,
Weil J.A. (2004). Free radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies, Food Chemistry, 84: 551-562.
3.            Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L. (2007). Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol. Annu. Rev., 265-301.
4.            El Dine R.S., El Halawayny A.M., Hattori M. (2008). Anti-HIV1 protease activity of lanostane triterpenes from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod., 71(6): 1022-1026.
5.            El Dine R.S., El Halawayny A.M., Norio Nakamura, ChaoMei MA, Hattori M. (2008). New lanostane triterpene lactones from the Vietnamese mushroom Ganoderma colossum
(FR.)C.F.BAKER., Chem. Pharm. Bull., 56(5): 642-646.
6.            Kleinwatcher P., Ngo Anh, T.T Kiet, Schlegel B., Dahse H. M., Hartl A., Grafe U. (2001). Colossolactones, new triterpenoid metabolistes from a Vietnamese mushroom Ganoderma colossum. J. Nat. Prod., 64(2): 236-239.
7.            Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008). Tác dụng của Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm. F. Nees, Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophospamid”, Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 12, phụ bản của số 4: 142-147.
8.            Nguyễn Thị Thu Hương, Ngô Minh Nghĩa (2009). Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của nấm Linh chi vàng (Ganoderma colossum, Ganodermataceae). Tạp chí Dược liệu, tập 14(6): 302306.
 9.           Stroev E. A., Makarova V. G. (1989). Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory. In: Manual in Biochemistry, Moscow, 243 -256.
 

Nhà phân phối