Tham khảo: Sắc ký cột, sắc ký lỏng cao hiệu năng, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, phụ kiện sắc ký

Dưới tác động của pha động, hợp chất mục tiêu được đưa đi qua pha tĩnh (thường là vật liệu có nhiều lỗ xốp). Để thu được phương pháp phân tách và tinh chế các axit amin và peptit từ các sản phẩm tự nhiên thành công đã phát triển nhiều kỹ thuật sắc ký khác nhau như: sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy, sắc ký khí GC, sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, vân vân. Sắc ký hấp phụ hoặc sắc ký phân bố được xem là phương pháp hiệu quả nhất.
 
I. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
 
Là kỹ thuật đơn giản nhất được sử dụng để tách và định tính các sản phẩm tự nhiên được quan tâm. Bằng phương pháp này, có thể dễ dàng thu được thông tin định tính và cung cấp dữ liệu cho việc định lượng. Pha tĩnh thường là silicagel phủ lên tấm TLC hoặc HPTLC (TLC hiệu năng cao) – các tấm này thường là các tấm thủy tinh silica hoặc oxit nhôm hoặc nhựa. Pha động là chất rửa giải (hỗn hợp dung môi). Trên thực tế, các hợp chất được quan tâm phải được hòa tan ở các độ tan khác nhau. Tiếp tục quá trình tách một lần nữa để hình thành sự phân bố cân bằng các cấu tử trong hỗn hợp.




Quá trình tách phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
 
a) Độ hòa tan trong pha động,
 
b) Lực hấp dẫn hoặc sự hấp thụ giữa hợp chất và SiO2, càng có nhiều hợp chất tương tác với silica, thì càng ít cấu tử bị di chuyển đi lên,
 
c) Kích thước hoặc khối lượng phân tử MW của hợp chất, với mục đích là hợp chất càng lớn, thì nó di chuyển càng chậm lên các bản mỏng.
 
Bởi vì các acid amin là những hợp chất không màu, nên ninhydrin thường được dùng để làm chất chỉ thị phát hiện ra các acid amin đó, nhờ vào sự hình thành phức chất Ruhemann màu tím xanh khi ninhydrin tác dụng với acid amin. Người ta cũng áp dụng phương pháp khác để phát hiện acid amin là sử dụng tác nhân anisaldehyde-H2SO4, kết hợp với gia nhiệt (120oC, trong 5 phút).
 
Các dung môi hữu cơ khác như alcohol, dioxane, methyl cellosolve, pyridine, và phenol được sử dụng để thúc đẩy nhanh sự hình thành phức màu, cường độ màu thu được cũng khác nhau, hỗn hợp phenol-pyridine được xem là dung môi hiệu quả nhất. Dưới nhiệt độ 105^oC trong khoảng 3-5 phút làm tăng hiệu quả tạo màu đối với hầu hết các acid amin, trừ trytophan và lysine.
 
Giá trị hệ số di chuyển (viết tắt là R_f) của mỗi hợp chất có thể được tính toán và so sánh với các giá trị tham chiếu tương ứng, để định lượng các acid amin đặc trưng. Giá trị R_f đối với mỗi hợp chất đã biết cần được giữ nguyên, để quan sát sự phát triển của bản mỏng với cùng loại dung môi, cùng loại bản mỏng sử dụng, cùng phương pháp chấm điểm và trong cùng các điều kiện khác hoàn toàn tương tự.



II. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
 
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được xem là phương pháp tách các thành phần từ hợp chất tự nhiên thích hợp và hiệu quả nhất. Đây cũng là phương pháp tách hiệu quả hàng đầu được sử dụng trong phép phân tích các acid amin (AAA) từ các sản phẩm tự nhiên, cho phép phân tách và phát hiện bằng phương pháp hấp thụ tia tử ngoại hoặc huỳnh quang. Tuy nhiên, các acid amin phổ biến nhất không chứa nhóm mang màu, do đó thường phải tạo thêm dẫn xuất trước khi tiến hành HPLC hay phản ứng sau cột (post-column).
 
Các acid amin là các phân tử rất phân cực, do vậy các phương pháp sắc ký thông thường như sắc ký lỏng hiệu năng cao kiểu phân bố pha đảo (RP-HPLC), hay sắc ký khí (GC) không thể thực hiện mà không tạo dẫn xuất.
 
Qui trình tạo dẫn xuất có một số mục đích như sau:
 
+ Làm tăng khả năng bay hơi,
 
+ Giảm khả năng hoạt hóa, hoặc
 
+ Cải thiện hiệu quả và cách phân tích sắc ký của các hợp chất được quan tâm.
 
Trong trường hợp của các acid amin, tạo dẫn xuất là quá trình thay thế các nguyên tử Hyđro hoạt động trong các nhóm hydroxyl (-OH), amino (-NH2) và nhóm -SH bằng một phần tử không phân cực. Phần lớn các quá trình tạo dẫn xuất liên quan đến phản ứng với các nhóm amino: thường là các amine cơ sở, nhưng cũng có các amine thứ cấp (gồm proline và hydroxyproline), hoặc dẫn xuất của nhóm carboxyl (-COOH) trong cấu trúc axit amin.
 
Một số phương pháp sắc ký lỏng chuyên dụng trong định lượng amino acid như sắc ký trao đổi ion (IEC) vàsắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Hai phương pháp này đều cần bước tạo dẫn xuất tiền cột hoặc sau cột. Mặc dù kỹ thuật này cho độ phân giải và độ nhạy phù hợp, nhưng quá trình tạo dẫn xuất lại làm tăng độ phức tạp, giá thành và thời gian phân tích.
 
 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kết hợp bộ tạo dẫn xuất sau cột với tác nhân ninhydrin là một trong những phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất để định lượng acid amin. Quá trình tách các axit amin trên cột trao đổi ion được thực hiện kết hợp với sự thay đổi độ pH và độ mạnh yếu của các ion (cation) để tăng hiệu quả tách áp dụng thêm chu trình Gradient nhiệt độ.
 
Nhưng có lẽ phương pháp hiệu quả nhất hiện nay là phương pháp sắc ký trao đổi cation (CEC) trong môi trường dung dịch đệm (thường là một dung dịch đệm liti), kết hợp bộ tạo dẫn xuất sau cột với tác nhân ninhydrin, đầu dò hấp thụ UV. Bằng cách này ta tách được các acid amin mong muốn, dựa theo màu sắc (cấu trúc) của dẫn xuất tạo thành. Các axit amin chứa các amin cơ sở (trừ acid imino) cho màu tím, và có thấy độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 570 nm. Các acid imino (như proline) tạo màu vàng, và độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 440nm. Phản ứng sau cột giữa ninhydrin và acid amin (được rửa giải khỏi cột sắc ký) được điều chỉnh trong vùng bước sóng 440 và 570 nm.
 
OPA là một loại tác nhân khác được dùng cho cả quá trình tạo dẫn xuất sau cột và tiền cột. Ortho-phthaldehyde (OPA) phản ứng tại vị trí nhóm amino, trong sự có mặt của một thiol (mercaptoethanol), kết quả tạo ra một dẫn xuất huỳnh quang, quang hoạt tử ngoại tại bước sóng 340 nm.
 
Một số tác nhân khác tạo dẫn xuất tiền cột của các nhóm amin tự do trong phân tử amino acid như: PITC (phenylisothiocyanate), DABS-Cl (dimethylamino-azobenzenesulfonyl chloride), Fmoc-Cl (9-fluorenylmethyl-chloroformate), NBD-F (7-fluoro-4-nitro-2-aza-1,3-diazole), … Thời gian phản ứng phụ thuộc vào loại tác nhân và các nhóm chức, nhóm phản ứng có liên quan.
 
 Sắc ký lỏng pha đảo cặp ion kết hợp với đầu dò khối phổ, IPRPLC-MS/MS là kỹ thuật cho phép phân tích các axit amin mà không cần tạo dẫn xuất, do đó giảm các lỗi phát sinh do các tác nhân, nhiễu, dẫn xuất tạo thành không bền, các phản ứng phụ, … Sử dụng tác nhân tạo dẫn xuất dễ bay hơi, quá trình phân tách bằng kỹ thuật cặp ion (ion pair – IP) dựa trên hai cơ chế khác nhau như sau:
 
a) Tác nhân IP được hấp thụ tại bề mặt giữa pha tĩnh và pha động; và
 
b) Sự hình thành của một lớp khuếch tán và điện thế bề mặt tĩnh điện phụ thuộc vào nồng độ bề mặt của tác nhân IP.



Sắc ký khí (GC) được dùng trong tách và phân tích các hợp chất dễ bay hơi mà không làm phân hủy chúng.
 
Quá trình tạo dẫn xuất thường gặp nhất là quá trình silyl hóa (đưa nhóm thế vào phân tử), đây là phương pháp mà trong đó hydro axit được thay thế bằng nhóm alkylsilyl.
 
Thông thường, các tác nhân silyl hóa là: BSTFA (N,O-bis-(tri-methyl-silul)-trifluorocetamide và MSTFA (N-methyl-silyl-trifluoro-acetaide). Nhược điểm của phương pháp này là tác nhân và dẫn xuất dễ bị tác động bởi độ ẩm và tính không ổn định của dẫn xuất. Có một số axit amin không bền (như arginine và acid glutamic). Arginine phân hủy thành ornithine, còn acid glutamic bị sắp xếp lại cấu trúc thành acid pyro-glutamic.
 
Một phương pháp tạo dẫn xuất trong GC là phương pháp axyl hóa hoặc este hóa, tác nhân hiện nay được sử dụng là kết hợp một andehit và rượu (anđehit pentafluorpropyl hoặc trifloroformate và isopropanol) hoặc alkyl chloroformate và rượu.
 
Quá trình silyl hóa diễn ra thông qua quá trình thay thế trực tiếp của nhóm carboxyl tạo este và các nhóm amin thành carbamate, phản ứng được xúc tác bởi một chất mang tính bazơ (như pyridine hoặc picoline). Các este alkyl cực kỳ bền và có thể giữ được trong một thời gian dài.
 
Sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS) là phương pháp phân tích với độ lặp lại thời gian lưu tốt, và dễ tự động hóa.
 
Nhược điểm chính của kỹ thuật này là do tính kém bền với nhiệt độ của một số hợp chất và/hoặc dẫn xuất của chúng, rất khó để phân tích dưới hầu hết các điều kiện của sắc ký khí (GC). Phổ khối là một trong số những kỹ thuật hiệu quả nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất tự nhiên. Kỹ thuật khối phổ hoạt động dựa trên việc tách ra của các ion tạo bởi nguồn ion hóa và tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z) của chúng.
 
Kỹ thuật này cho phép đo chính xác khối lượng phân tử (MW), xác nhận mẫu, chứng minh độ tinh khiết của mẫu, kiểm tra sự thay thế, và trình tự sắp xếp của các axit amin. Quá trình này rất hữu hiệu trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ và trình tự sắp xếp của oligo-nucleotit hoặc của chuỗi polypeptit .
 
Ưu điểm chính của MS là chỉ yêu cầu một lượng mẫu rất nhỏ (từ ng đến pg).
 
Phương pháp ion hóa thông thương có nhược điểm (chẳng hạn, ion hóa bằng nhờ sự va chạm electron, API) là chỉ áp dụng được với các hợp chất có độ bay hơi, độ phân cực và khối lượng phân tử MW phù hợp. Khả năng bay hơi của hợp chất có thể tăng lên khi bị tác động bởi phản ứng hóa học (quá trình tạo dẫn xuất, như: quá trình metyl hóa, trimetylsilyl hóa hay phản ứng triflouro acetyl hóa).
 
Đối với các peptit, hiện có một số kỹ thuật ion hóa mới hiệu quả cao, như: phương pháp ion hóa chùm điện tử(ESI) và ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng lazer (MALDI).
 
Một số nghiên cứu khoa học liên quan đến quá trình tạo dẫn xuất trong phân tích các axit amin AAA:
 
+ Phương pháp sắc ký giấy của Moore và Stein thực tế ngày nay vẫn được ứng dụng. Phương pháp này đã sử dụng tác nhân nynhidrin đã biến tính để xác định trắc quang các axit amin, đây là cơ sở cho các phương pháp dẫn suất khác.
 
+ Melucci và cộng sự trình bày một phương pháp định lượng các acid amin tự do – tạo dẫn xuất tiền cột bằng 9-Fluorenylmethylchloroformate, sau đó tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC).
 
+ Kochhar và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) để định lượng các axit amin, có sử dụng tác nhân tạo dẫn xuất 1-Fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanile, còn gọi là tác nhân Marfey. Phương pháp này được ứng dụng thành công để định lượng 19 loại amino acid L (L-amino acid) dựa trên cơ sở phản ứng cân bằng giữa tác nhân và các nhóm amin trong acid amin
 
+ Ngo Bum và đồng nghiệp đã dùng phương pháp sắc ký trao đổi cation (ion dương) và tạo dẫn xuất tiền cột bằng ninhydrin để phát hiện các axit amin tự do từ các chiết xuất thực vật.
 
+ Culea đã tạo dẫn xuất của axit amin với trifluoroacetic khan, sau đó chiết với nhựa trao đổi ion và phân tích bằng GC/MS.
 
+ Warren đã sử dụng phương pháp của điện di mao quản CE, và điện di mao quản kết hợp nguồn huỳnh quang laze cảm ứng (capillary electrophoresis–laser-induced fluorescence CE-LIF) để định lượng các axit amin từ các chiết xuất từ đất với ưu điểm về giới hạn phát hiện thấp và độ đặc hiệu cao.
 
+ Vào năm 2010, Sun và các cộng sự đã sử dụng một phương pháp khác để phát hiện các axit amin từStellera chamaejasme L., một loài thảo dược được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Trung Quốc; tác nhân cho quá trình dẫn xuất DBCEC (2-[2-(dibenzocarbazole)-ethoxyl] ethyl chloro-formate), cuối cùng thu được các amino acid dẫn xuất bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò huỳnh quang.
 
+ Li và cộng sự đã phát triển một phương pháp mới trong phát hiện các acid amin từ măng tây. Sau khi dẫn xuất hóa của các mẫu bằng 4-chloro-3,5-dinitro-benzotrifluoride (CNBF), tiếp tục chiết pha rắn trên cột C18, và cuối cùng được phân tích bằng HPLC.
 
+ Zhang và cộng sự đã đề xuất một phương pháp sắc ký cải tiến (bằng cách tối ưu hóa pha động và gradient nồng độ) để phát hiện đồng thời 21 acid amin tự do trong lá trà.
 
III. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
 
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân mang lại các thông tin hữu ích và giá trị nhất về cấu trúc có thể của bất kỳ sản phẩm tự nhiên nào. Phương pháp này có ưu điểm khả năng lặp lại vượt trội. Mặc dù đây vẫn là một trong những phương pháp tốn kém, kỹ thuật NMR tương đối rẻ, độ nhạy cao và dễ dàng sử dụng cho việc phân tích axit amin thông thường.
 
Nguồn: Peptide and Amino Acids Separation and Identification from Natural Products – Tác giả: Ion Neda1, Paulina Vlazan1, RalucaOana Pop1, Paula Sfarloaga1, Ioan Grozescu1 và Adina-Elena Segneanu DOI: 10.5772/51619
 
Sách: “Analytical Chemistry”, book edited by Ira S. Krull, ISBN 978-953-51-0837-5, Published: November 7, 2012