SBC Scientific - Vai trò của các chất chống oxy hoá trong việc hình thành phôi soma với Conestephium pendulum Ericace

Vai trò của các chất chống oxy hoá trong việc hình thành phôi soma với Conestephium pendulum Ericace

Vai trò của chất chống oxy hoá trong trong việc hình thành phôi soma với Conestephium pendulum (Ericaceae): Việc sử dụng loài Conendephium pendulum như “mô hình” nghiên cứu Ericaceae đã được tiến hành để điều tra vai trò của sự mất cân bằng oxy hóa đối với khả năng hình thành phôi của mô và mô sẹo.
Ba chất chống oxy hoá được nghiên cứu như một phương pháp tiền xử lý mô và kết hợp với môi trường tăng trưởng. Phương pháp tiền xử lý các mô tế bào bằng tripotassium citrate và acid citric làm giảm đáng kể hoại tử mô sẹo, tuy nhiên việc xử lý này đã làm giảm đáng kể số lượng phôi soma khi so sánh với việc chuẩn bị mô dưới nước cất vô trùng. Sự kết hợp của tripotassium citrate và acid citric với môi trường nuôi cấylàm giảm đáng kể quá trình nâu hóa phenolic, tuy nhiên điều trị này không có ảnh hưởng đáng kể đến số lượng phôi somatic được hình thành, điều này cho thấy việc phòng ngừa quá trình hóa nâu ở mô có thể là khả thi bằng cách giảm sự tiếp xúc với oxy trong quá trình xử lý mô nuôi cấy.

Giới thiệu:

   Các nghiên cứu ban đầu về tiềm năng hình thành phôi soma của các loài Ericaceous khác nhau (Anthony, 2002) cho biết các mô nuôi cấy, đặc biệt là ở hoa, thường bị “nâu hóa”trong những ngày nuôi cấy. Từ những quan sát này đã gợi ý rằng việc ngăn ngừa hiện tượng "nâu hóa" có thể là cần thiết trong việc nuôi cấy các loài này. Vì vậy, các thí nghiệm được tiến hành bằng cách sử dụng Conendephium pendulum Benth như là một mô hình thí nghiệm của loài Ericaceae để nghiên cứu xem liệu sự ngăn ngừa quá trình oxy hóa có thể có trong nuôi cấy in vitro và liệu sự mất cân bằng oxy hóa đối với mô và mô sẹo có thể làm giảm khả năng hình thành phôi của tế bào soma (hình 1B-F). 
Benson (2000) đưa ra giả thuyết rằng các thao tác trong nuôi cấy mô gây ra sự chuyển hóa quan trọng và những chuyển biến thực nghiệm, một số trong đó có thể ảnh hưởng việc gia tăng sự hình thành các gốc tự do trong nuôi cấy in vitro, dẫn đến rối loạn chức năng tế bào và cản trở sự nuôi cấy. Mô nuôi cấy bị hóa nâu sau đó chết đi thường do các hợp chất phenolic là một vấn đề nghiêm trọng trong việc bắt đầu nuôi cấy những cây gỗ (Thomas và Ravindra, 1997).
 
   Sự tác động của Phenolic thể hiện qua sự sẫm màu ở mô nuôi cấy có thể dẫn tới làm chết vật liệu nuôi cấy (Taji và Williams, 1996). Các gốc Oxy tự do có thể được tạo ra ở những vết cắt và dẫn tới làm tăng hoạt động của các enzyme peroxidase và catalase (Salin và Bridges, 1981; Thompson và cộng sự, 1987), nhằm tác động đến những ảnh hưởng của các gốc oxy hóa. Việc giảm sự tiếp xúc với oxy làm giảm tốc độ oxy hóa phenol tại những vết cắt (Elmore và cộng sự, 1990) dẫn đến việc để các mô nuôi cấy chìm ngập trong nước như một cách để giảm quá trình oxy hóa mô.

Hoa-C-pendulum.png
Hình 1. (A) Hoa C. pendulum với các chồi phát triển tích cực; (B) Phần thân đen với mô sẹo bị hóa nâu; (C)Mô lá không bị hóa nâu; (D) Mô lá có những phần bị hóa nâu nâu; (E) Mô lá bắc với mô sẹo  không bị nâu hóa phenolic; (F) Mô lá bắcbị hóa nâu nhiều. Thanh dải: A đại diện cho 30 mm; B, C và D đại diện là 5 mm; E và F đại diện là 1 mm.

   Một số chất chống oxy hoá đã được đánh giá với sự thành công khác nhau trong việc kiểm soát  thiệt hại do phenolic từ các mô bị loại bỏ. Sự kết hợp các hóa chất như acid ascorbic kết hợp với acid citric và cystein ngăn cản sự hóa nâu ở Musa textilis (Mante và Tepper, 1983). Quá trình tiền xử lý mô bằng cách rửa với dung dịch acid ascorbic và axit citric thường được sử dụng để kìm hãm quá trình hóa nâu ở Aechmea fasciata (Jones và Murashige, 1974); M. textilis (Mante và Tepper, 1983); Rhododendron (Anderson, 1975).
 
   Benson và cộng sự (1995) báo cáo rằng hợp chất dạng keo của sắt, desferrioxamine, đã có một ảnh hưởng tích cực đến việc phục hồi sau khi bảo quản lạnh cho các tế bào Oryza sativa. Desferrioxamine đã được sử dụng để làm giảm sự tổn hại gốc tự do ở động vật, đặc biệt là khi các kim loại chuyển tiếp liên quan đến việc xúc tác cho quá trình sản xuất các gốc tự do. Các kim loại chuyển tiếp đặc biệt là sắt có vai trò chính trong việc cân bằng lại sự mất cân bằng oxy hóa ở gốc tự do (Benson et al., 1995).
 
   Tocopherols cũng được biết là có hoạt tính chống oxy hoá cao (Ohkatsu và cộng sự, 2001), cơ chế hoạt động của tocopherols dựa trên những phát hiện cho thấy một mol của tocopherol có thể bẫy hơn hai mol phân tử gốc, và có thể bẫy các gốc alkyl cũng như các gốc peroxy.
 
   Một số nhà nghiên cứu đã quan sát thấy sự hóa nâu của mô và hoại tử không nhất thiết có hại đến hình thái học, ví dụ ở Vitis vinifera (nho) phôi soma đã xuất hiện bên cạnh các vùng hoại tử (Krul và Worley, 1977) trong khi ở Paulownia tomentosa, sự có mặt của mô hoại tử rõ ràng là cần thiết cho sự khởi đầu của phôi tế bào (Radojevic, 1979). Ba chất chống oxy hoá đã được lựa chọn cho nghiên cứu này dựa trên việc sử dụng thành công trước đây (Anderson, 1975, George, 1993, Benson và cộng sự, 1995). Sự hóa nâu mô ở Ericaceae  diễn ra nhanh và chủ yếu liên quan đến toàn bộ mô nuôi cấy/mô sẹo, không có lợi ích trực tiếp cho sự hình thành SE (Anthony, 2002). 

Cac-buoc-đieu-tri-voi-ba-chat-chong-oxy-hoa.png
Hình 2. Các bước điều trị với ba chất chống oxy hoá. (A) Tri-kali citrate (KC) và axit xitric (CA) (0,75 g / l: 0,25 g / l); (B) Tocopherol acetate (toc); (C) Desferrioxamine (desf).
 
   Do đó, nghiên cứu này đã được tiến hành để khảo sát tiềm năng của các chất chống oxy hoá trong việc ngăn ngừa quá trình oxy hóa mô và mô sẹo phát triển và để xác định ảnh hưởng của chúng đối với lượng phôi soma hình thành ở cây cọ Úc Ericaceous C. pendulum.
 
Vật liệu và phương pháp
 
   Vật liệu nuôi cấy được thu thập bằng cách cắt tỉa cẩn thận từng đoạn chồi đang phát triển tích cực dài từ 5-10 cm (Hình 1A). Đối với quá trình khử nhiễm trước khi đưa vào nuôi cấy vô trùng, những đoạn chồi được rửa dưới nước máy trong 1 giờ. Tiếp theo mẫu được xử lý với HgCl2 0,25% trong 6 phút, và sau đó rửa lại 5 lần trong nước cất vô trùng (sdw). Các mô lá của C. pendulum Benth được cắt từ thân cây trong khi vẫn còn đính chồi nhỏ của mô thân.
Trong quá trình xử lý, các mô được phơi ra với không khí, ngập trong nước cất vô trùng hoặc trong các dung dịch chống oxy hoá cụ thể (Hình 2). Trong số các phương pháp xử lý, các chất chống oxy hoá được đưa vào trong môi trường nuôi cấy (Hình 2). Chất chống oxy hoá được sử dụng là potassium citrate (KC) với citric acid (CA) (nồng độ 0.01 hoặc 0.1% w/v KC/CA (0.75 và 0.25 g l-1), tocopherol acetate (toc) ở nồng độ 0.1, 0.5 hoặc 5 mM; Desferrioxamine (desf) (nồng độ 10 hoặc 100 mg l-1) (Hình 2). Để xác định ảnh hưởng của kali đối với số lượng phôi soma, hai nồng độ KCl đã được đánh giá (10 và 20 mM).
 
   Môi trường nuôi cấy phôi bao gồm muối B5 của Gamborg (GB5) (Gamborg và cộng sự, 1968) bổ sung 10 mg l-1 thiamin HCl, 5 mg l-1 pyridoxin HCl, 5 mg l-1 nicotinic acid, 30 gl-1 Sucrose và 7 g l-1 agar và các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật (PGR) 10μM zeatin và 5μM indolo-3-axetic acid (IAA). Tất cả các PGR và các chất chống oxy hoá được lọc khử trùng và thêm vào sau khi hấp. Sau đó các mô được đưa vào điều kiện thích hợp, với bề mặt cắt tiếp xúc với môi trường (Anthony, 2002).
 
   Trong tất cả các thí nghiệm, một mô hình hoàn toàn ngẫu nhiên đã được sử dụng. Mỗi lần thử nghiệm bao gồm 10 mẫu mô, được nhân giống 5 lần. Vật liệu nuôi cấy được quan sát mỗi 3-7 ngày và quan sát cuối cùng được ghi lại sau 8 tuần. Các mô tê bào và mô sẹo bị hoại tử được đánh giá theo thang điểm từ 0-10 với 0 = không có nâu và 10 = hoàn toàn đen. Phân tích phương sai được thực hiện và phương pháp khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (Fisher's LSD) ở khoảng tin cậy 95% được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể giữa các phương pháp điều trị.
 
Kết quả và thảo luận
 
   Ba chất chống oxy hoá được cho là có hiệu quả trong nuôi cấy mô đã được nghiên cứu (Hình 2) với C. pendulum: tri-potassium citrate và acid citric (Panaia và cộng sự, 2000), Tocopherol acetate (George, 1993) và desferrioxamine (Benson và cộng sự. , 1995). Tri-potassium citrate và acid citric (0,01%) kết hợp với môi trường đã làm giảm đáng kể sự hoại tử mô (Hình 3A, T1 và T4) tuy nhiên, phương pháp này không có ảnh hưởng nhiều đến số lượng phôi somatic được hình thành. Nồng độ KC/CA 0,1%trong môi trường nuôi cấy làm tăng đáng kể sự hoại tử mô (Hình 3A, T2, T5 và T8). Việc tiền xử lý các mẫu mô nuôi cấy với KC/CA 0,1% làm giảm đáng kể sự hoại tử mô sẹo, tuy nhiên lại làm giảm đáng kể số lượng SE khi so sánh với việc chuẩn bị mô dưới nước (Hình 4A).

Muc-đo-hoai-tu-cua-la-va-hoai-mo-seo-khi-mau-nuoi-cay-C-pendulum.png
Hình 3. Mức độ hoại tử của lá và hoại mô sẹo khi mẫu nuôi cấy C. pendulum được tách ra và nuôi cấy trên các phương pháp xử lý chống oxy hoá khác nhau. (A) Tri-kali citrat và axit xitric; (B) Tocopherol; (C) Desferrioxamine

So-luong-phoi-somatic-trung-binh-đuoc-hinh-thanh-tren-mot-mo-C-pendulum.png
Hình 4. Số lượng phôi somatic trung bình được hình thành trên một mô C. pendulum được nuôi cấy trên các phương pháp xử lý chống oxy hoá. (A) Tri-kali citrat và axit xitric; (B) Tocopherol; (C) Desferrioxamine
So-luong-phoi-somatic-trung-binh-tren-moi-lan-bon-khi-mo-phat-hien-trung-pentulum.png
Hình 5. Số lượng phôi somatic trung bình trên mỗi lần bón khi mô phát hiện trứng pentulum được nuôi cấy trên kali clorua. Giá trị đại diện cho trung bình năm lần lặp lại
 
   Giảm lượng SE hình thành không thể là do việc bổ sung kali trong KC/CA do thử nghiệm thêm đã cho thấy rằng việc bổ sung potassium clorua (KCl) đã làm tăng sản xuất SE (Hình 5). Kết quả này không phải là do ảnh hưởng pH sau khi bổ sung KC/CA. Chúng tôi không rõ liệu acid citric làm giảm SE so với xử lý mô dưới nước, đây có thể không phải là một tác động độc hại của acid citric vì nó là sản phẩm đầu tiên được hình thành trong chu kỳ Krebs, và do đó người ta hy vọng rằng bất kỳ sự bổ sung acid citric nào cũng sẽ được chuyển hóa. Giả thuyết này được chứng minh bằng việc quan sát rằng việc thử nghiệm với mức độ tăng lên của nguồn cacbon, tức là đường, đã làm tăng SE ở cây Ericaceous Leucopogon verticillatus (Anthony et al., 2004) và Astroloma xerophyllum (Anthony, 2002). Acid citric là một chất chống oxy hoá, trong khi nó có thể có lợi trong việc giảm quá trình oxy hóa phenol ban đầu, sự có mặt của các mức độ cao hơn có thể đã can thiệp vào các hệ thống vận chuyển điện tử gây rối loạn chuyển hóa năng lượng trong quá trình tăng trưởng nhanh.
 
   Việc chuẩn bị các mô thí nghiệm bằng cách thao tác dưới nước (T3) làm giảm sự hóa nâu của mô (Hình 3) và tăng cường số lượng SE (Hình 4). Việc sử dụng cả tocopherol và desferrioxamine làm tăng đáng kể sự hoại tử lá và mô sẹo (Hình 3B và C), và không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành SE (hình 4). Tại sao những chất chống oxy hoá này lại làm tăng sự hóa nâu của mô vẫn cần được làm sáng tỏ. Desf được coi là một hợp chất keo ion và ức chế phản ứng Fenton bằng cách loại bỏ các kim loại chuyển tiếp (Benson và cộng sự, 1995). Tuy nhiên bổ sung desf đã gây bất lợi đến môi trường có hoặc không có cation (cation tự do). Các lý do của sự quan sát này không rõ ràng vào thời điểm này. Các chất chống oxy hoá hoạt động như một hệ thống, là nơi tiếp nhận các electron được đưa lên bởi một phân tử khác và tiếp tục giải phóng các chất nhận điện tử để hoạt động như một chất nhận electron. Tuy nhiên, việc thiếu các hệ thống kiểm soát như vậy có thể đã cản trở các hiệu quả của các chất chống oxy hoá ngoại sinh. Chất chống oxy hoá cũng có thể hoạt động như các nhà tài trợ điện tử trong một số trường hợp nhất định, tăng cường quá trình oxy hóa. Việc áp dụng các chất chống oxy hoá liên quan đến lipid, màng tế bào như tocopherol có thể không hiệu quả vì những phân tử này có thể không có 'vị trí' đúng cách trong màng.
 
   Các kết quả này chỉ ra rằng việc ngăn ngừa quá trình oxy hóa trong quá trình cắt bỏ mô để nuôi cấy là rất quan trọng và việc ngăn ngừa sự tiếp xúc trực tiếp của mô với không khí là thuận lợi hơn so với sử dụng các chất hóa học trung gian có thể gây trở ngại cho các sự phát triển tiếp theo. Một quy trình đơn giản để chuẩn bị khử nhiễm các vật liệu nuôi cấy dưới nước cất vô trùng trước khi nuôi cấy đã được phát triển theo kết quả của nghiên cứu này, kết quả là làm giảm sự chết của mô gây ra bởi quá trình oxy hóa phenol và do đó làm tăng số lượng SE.
 
Lời cảm ơn
 
Chúng tôi cảm ơn MERIWA, Alcoa và Iluka Resources về hỗ trợ tài chính của họ, cho Eric Bunn vì lời khuyên của ông và Anthony Bishop về sự trợ giúp của ông trong phòng thí nghiệm.
 
Tài liệu tham khảo
Anderson WC (1975) Propagation of rhododendrons by tissue cul- ture. I. Development of a culture medium for multiplication of shoots. Comb. Proc. Int. Plant Prop. Soc. 25: 129–135
Anthony JM (2002) Somatic embryogenesis in the Western Australian Epacridaceae. PhD Thesis, University of Western Australia
Anthony JM, Senaratna T, Dixon KW & Sivasithamparam K (2004) Somatic embryogenesis for mass propagation of Ericaceae – a case study with Leucopogon verticillatus. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 76: 137–146
Benson EE (2000) Do free radicals have a role in plant tissue culture recalcitrance? In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 36: 163–170
Benson EE, Lynch PT & Jones J (1995) The use of the iron chelating  agent desferrioxamine  in rice cell  cryopreservation: a novel approach for improving recovery. Plant Sci. 110: 249–258
Elmore HW, Samples B, Sharma S & Harrison M (1990) Influ- ence of cultural and physiochemical factors on ascorbate stability in plant tissue culture media. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 20: 131–135
Gamborg OL, Miller RA & Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151–158
George EF (1993) Plant Propagation by Tissue Culture Part 1. The Technology. 2nd Edn. Exegetics Limited, Edington, UK
Jones JB & Murashige T (1974) Tissue culture propagation Aech- mea fasciata Baker and other Bromeliads. Comb. Proc. Int. Plant PROP. SOC. 24: 117–126
Krul WR & Worley JF (1977) Formation of adventitious embryos in callus cultures of ‘Seyval’, a French hybrid grape. J. Am. Soc. Hort. Sci. 102: 360–363
Mante S & Tepper HB (1983) Production of Musa textilis Nee plants from apical meristem slices in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2: 151–159
Nichol JW, Slade D, Viss V & Stuart DA (1991) Effect of organic acid pretreatment on the regeneration and development (conver- sion) of whole plants from callus cultures of alfalfa, Medicago sativa L. Plant Sci. 79: 181–192
Ohkatsu Y, Kajiyama T & Ari Y (2001) Antioxidant activities of tocopherols. Poly. Deg. Stab. 72: 303–311
Panaia M, Senaratna T, Bunn E, Dixon KW & Sivasithamparam K (2000) Micropropagation of the critically endangered Western Australian species Symonanthus bancroftii (F. Muell.) L. Haegi (Solanaceae). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63: 23–29
Radojevic L (1979) Somatic embryos and plantlets from callus cultures of Paulownia tomentosa Steud. Z. Pflanzenphysiol. 91: 57–62
Salin ML & Bridges SM (1981) Chemiluminescence in wounded root tissue. Plant Physiol. 67: 43–46
Taji A & Williams R (1996) Tissue Culture  of Australian   Plants.
University of New England, Armidale NSW, Australia
Thomas P & Ravindra MB (1997) Shoot tip culture in mango: influ- ence of medium, genotype, explant factors, season and decon- tamination treatments on phenolic exudation, explant survival and axenic culture establishment. J. Hort. Sci. 72: 713–722
Thompson JE, Legge RL & Barber RF (1987) The role of free- radicals in senescence and wounding. New Phytol. 105: 317–344

Hiếu Minh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: [email protected]

 
 

Nhà phân phối