Tóm tắt:
 

   Mít (Artocarpus heterophyllus L.) được biết đến như là một loại cây tự nhiên của Bangladesh, ra quả giữa tháng 6 và tháng 8. Nhân giống cây mít từ hạt không phổ biến bởi vì biến dị cao. Để duy trì được chất lượng quả, kỹ thuật nuôi cấy mô được sử dụng để nhân giống mít quanh năm. Các chồi khỏe mạnh và trưởng thành được sử dụng làm mẫu và nuôi cấy trong môi trường Murashige-Skoog (MS) bổ sung với nồng độ khác nhau (0 mg /L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L và 4 mg/L) hoóc môn tăng trưởng thực vật, tức là BAP (6-benzyleaminopurine) cho mục đích phát triển nhiều chồi. Tái tạo chồi tốt hơn khi môi trường MS được bổ sung với 2 mg/L BAP. Tăng số lần cấy chuyền (tối đa đến 10 lần) để tần suất nhân chồi tăng lên. Các chồi này được nuôi cấy trên môi trường ½ MS đã được bổ sung thêm 0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L và 4 mg/L IBA (Indole-3-butyric acid) và quan sát thấy rằng môi trường chứa 2 mg/L IBA cho kết quả cao nhất về số lượng rễ/mẫu, độ dài rễ và nhanh tạo rễ.
 

 

1. Giới thiệu:
 

   Cây mít là một loại cây đa quả hai lá mầm (Artocarpus heterophyllus L.) thuộc họ Moraceae phát triển ở nhiều nước nhiệt đới ở Đông Nam Á, nhưng đặc biệt phong phú ở Ấn Độ và Bangladesh. Trái thường đạt trọng lượng 10-25 kg, phát triển vào mùa hè khi thiếu ngũ cốc lương thực. Phần ăn được là một nguồn carbohydrate, protein, vitamin và khoáng chất. Thịt quả chín có thể được ăn tươi hoặc bảo quản trong xi-rô. Ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, hạt, cây nảy chồi (budding), chiết cành, giâm cành non và nuôi cấy mô (Morton, 1987) là cách nhân giống cho mít. Cây mít có thể cho quả hai lần một năm (Roy et al, 1996)  đóng một vai trò quan trọng để cải thiện nền kinh tế quốc gia. Trái mít được sử dụng trong giai đoạn phát triển nhưng chưa chín, khi nó không có mùi khó chịu và excels cooked green breadfruit ( green breadfruit em tạm hiểu là quả có múi dạng sake và mít còn xanh, ý câu này là quả này còn xanh nầu lên thì tuyệt hơn). Quả tại thời điểm này đơn giản là cắt thành những khối lớn để nấu. Các miếng được đun sôi trong nước muối nhẹ cho đến khi mềm, khi thịt quả thật ngon được cắt khỏi vỏ và dùng như một loại rau quả, kể cả hạt, nếu được nấu chín kỹ, thì mềm và vị dễ chịu (Morton, 1987).
 

   Sự hình thành rễ bất định hay rễ được xác định bởi Skoog và Miller (1957) thông qua việc phát hiện ra cơ chế hình thành cơ quan (chồi và rễ) bằng cách thay đổi tỷ lệ cytokinin / auxin. Khi tỷ lệ cytokinin / auxins cao, nó tạo thuận lợi cho việc hình thành chồi nhưng sự hình thành rễ bị ức chế. Ngược lại thì hỗ trợ sự hình thành rễ. Các hợp chất auxins được sử dụng thường xuyên nhất là 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) và cytokinin là kinetin, benzyl adenine (BA), 6-benzylaminopurine (BAP) và 2-isopentenyl aminopurine (2ip) (Chawla, 2002).
 

   Nhiều nhà nghiên cứu, như Adiga et al (1998), đã nghiên cứu in vitro (nuôi cấy mô) của mít. Họ báo cáo rằng sucrose là nguồn carbon tốt, khi các môi trường nuôi cấy bổ sung sucrose hoặc đường thì cho nhiều chồi hơn và axit Gibberelic (6,0 mg/L) làm tăng chiều dài chồi. Singh và Tiwari (1996) đã đề cập đến việc nhân giống mít thành công bằng cách nuôi cấy các phân khúc đốt trên môi trường MS có chứa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, tức là sự kết hợp của BA 18 mg/L (benzyladenine) + 0.2mmg/L của IBA (Indole-3-butyric Axit). Số lượng chồi lớn nhất (4-5) được phát triển trên các phân khúc đốt, lấy từ các chồi non in vitro bằng cách tăng các nhánh phụ sau 4 lần cấy chuyền trên MS với 2 mg/L BA + 0,2 mg/l IBA, nuôi cấy rễ in vitro thành công (58,7%) ở ½ MS với 1 mg/L (các câu ni thì tác giả chỉ ghi vậy thôi nên em cũng không biết 1mg/L chất gì). Rajmohan và Mohankumaran (1988) đã đề cập rằng chế độ tối trong giai đoạn khởi đầu chỉ trong 4 tuần là cần thiết cho việc vi nhân giống thành công cây mít. Hazarika (2003) báo cáo rằng paclobutrazol (0.5-4 mg/L) trong môi trường tạo rễ làm giảm khí khẩu và héo sau khi chuyển sang compost, tăng lớp sáp đục (lớp sáp ngoài trước lớp cutin), thân ngắn, hàm lượng chlorophyll và rễ dày.
 

   Để nâng cao năng suất của các giống/canh tác; cần có một quy trình hiệu quả để nhân giống thực vật cần phát triển để đạt được thực vật chuyển gen. Mục tiêu chính của nghiên cứu này là:
 

− Thiết lập một quy trình phù hợp cho việc nhân giống mít từ đầu chồi.

− Tìm hiểu tác dụng của hoocmon tăng trưởng (BAP) đối với sự gia tăng chồi.

− Tìm hiểu tác động của hoocmon tăng trưởng (IBA) đối với sự sinh sôi của rễ.
 

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:
 

   Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc Phòng Công nghệ Sinh học tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Bangladesh (BARI), Gazipur, Bangladesh từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011.
 

2.1. Lấy mẫu: mẫu (chồi dài 5cm) cho thí nghiệm này lấy từ các cây mít khỏe mạnh
 

2.2. Khử trùng bề mặt: mẫu mít được khử trùng bề mặt lần đầu với 3g/L thủy ngân cloride trong 1 phút, rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng sau đó khử trùng bề mặt với NaOCl 5.25% trong 20 phút.
 

2.3. Khử trùng dụng cụ: Thủy tinh được chà bằng bàn chải trong bồn rửa nóng. Chúng được rửa sạch với nước máy và sau đó rửa sạch từ hai đến ba lần bằng nước cất và nếu cần thì hấp để làm sạch agar và để diệt bất kỳ nguồn nhiễm nào có mặt. Tất cả các loại thủy tinh cần vệ sinh đều được ngâm trong nước tẩy rửa trong 2 giờ đồng hồ, sau đó rửa lại bằng nước máy để loại bỏ các chất tẩy rửa. Các đĩa Petri, cốc, vv được gói bằng giấy nhôm và để trong nồi hấp ở 121 o C, 151 b (có thể là 15 lb và em không hiểu ý nói về thông số kỹ thuật gì) , trong 20 phút để khử trùng.
 

2.4. Giai đoạn thiết lập cho mẫu mít:
 

Các mẫu nuôi cấy riêng biệt trong ống nghiệm (150ml) chứa 20ml của các môi trường sau:

+ MS (đối chứng)

+ MS bổ sung 1mg/L BAP.

+ MS bổ sung 2 mg/L BAP.

+ MS bổ sung 3 mg/L BAP.

+ MS bổ sung 4 mg/L BAP.
 

Điều kiện nuôi cấy ở 272 oC dưới ánh sáng từ đèn trắng huỳnh quang cường độ khoảng 2000 lux trong 16h/ngày. Các mẫu được cấy chuyền qua môi trường tương tự mỗi 3 tuần.

Tần số tạo chồi được tính dựa vào công thức sau:

Tần số tạo chồi (%)=(số mẫu sống/số mẫu cấy)x100
 

2.5. Giai đoạn nhân nhanh: Chồi từ mẫu được nhân trong môi trường tái sinh và cấy chuyền qua môi trường tương tự ít nhất 2 lần trong 3 tuần.
 

2.6. Giai đoạn tạo rễ: Chồi mít 3 cm từ giai đoạn nhân nhanh chồi được cấy trên môi trường ½ MS cơ bản bổ sung Indole-3-butyric acid (IBA) ở các nồng độ 0,1,2,3,4 mg/L. mỗi nghiệm thức của các thí nghiệm trên có 30g/L sucrose và 16g/L agar.
 

3. Kết quả:
 

Có 3 giai đoạn của thí ngiệm này – giai đoạn khởi đầu, giai đoạn nhân nhanh và giai đoạn tạo rễ. Dữ liệu được ghi lại cẩn thận dựa theo các tiêu chí riêng.
 

3.1 Giai đoạn khởi đầu: 4 tuần sau thí nghiệm trên mẫu mít, dữ liệu được ghi lại là số chồi được tạo trên mỗi mẫu tại các nồng độ hormon khác nhau (hình 1).
 

3.2 Giai đoạn tạo chồi: rất rõ ràng từ bảng 1, BAP 2mg/L cho giá trị có ý nghĩa cao nhất của sự tạo chồi (8), tiếp theo là 3mg/L BAP (6), 4 mg/L (4), 1 mg/L (5) và 0mg/L (0). Sau 3 tuần, tiến hành cấy chuyền đầu tiên (hình 2-3)
 

3.3 Giai đoạn nhân nhanh: giai đoạn nhân nhanh được thể hiện trong hình 4-6 và dữ liệu được ghi nhận (bảng 2), sau 8 tuần gồm:
 

+ Số chồi sống/ mẫu tại các nồng độ chất điều hòa tăng trưởng khác nhau

+ Chiều cao chồi (cm)

+ Số lá

Bảng 1. Phản ứng của các nồng độ BAP trên môi trường MS trong sự tạo chồi
 

Nồng độ BAP (mg/L)	Số mẫu	Số mẫu phát sinh chồi
0.0	10	0
1.0	10	5
2.0	10	8
3.0	10	6
4.0	10	4

3.4 Số chồi/ mẫu: dữ liệu thu được từ bảng 2 cho thấy, BAP 2mg/L cho giá trị có ý nghĩa cao nhất (100%) số chồi/ mẫu khi so với các nồng độ 3mg/L (90%), 4mg/L (80%), 1mg/L (80%)
 

3.5 Chiều cao trung bình (cm): từ bảng 2, tại 2mg/L BAP cho chiều cao chồi có ý nghĩa cao nhất (3.84 cm) và chiều cao thấp nhất (2.7 cm) tại 1 mg/L.
 

Hình 1: Chồi tại các nồng độ BAP khác nhau sau 15 ngày của thí nghiệm

Hình 2: Sau lần cấy chuyền đầu tiên tại các nồng độ BAP khác nhau

Hình 3: Tỉ lệ tạo chồi tại các nồng độ BAP khác nhau
 

Bảng 2: Phản ứng trên các môi trường MS có nồng độ BAP khác nhau trong nhân nhanh chồi

 

Nồng độ BAP (mg/L)	Số mẫu	Số chồi/nuôi cấy nhân chồi	Chiều cao chồi/ nuôi cấy	Số lá trung bình/nuôi cấy
1.0	10	08	2.70	2
2.0	10	10	3.84	4
3.0	10	09	3.30	3
4.0	10	08	2.80	3

 

Hình 4. Nhân nhanh của mẫu

Hình 5. Mẫu được nhân nhanh

Hình 6. Hiệu quả của BAP lên nhân nhanh chồi

 

3.6 Số lá trung bình/mẫu: kết quả trong bảng 2 rõ ràng cho thấy, 2mg/L BAP cho số lá/mẫu cao nhất là 4, sau hai lần cấy chuyền và thấp nhất là 2 tại 1mg/L khi cùng là 3 tại 3 và 4 mg/L.
 

3.8 Giai đoạn tạo rễ: mẫu mít theo dõi trong phòng nuôi 4 tuần (hình 7) để xác định dữ liệu tạo rễ (bảng 3)
 

Số ngày hình thành rễ

Số rễ/ mẫu

Chiều dài rễ cm
 

Bảng 3. Hiệu quả của các nồng độ IBA khác nhau trên môi trường ½ MS để hình thành và phát triển rễ mít
 

Nồng độ IBA (mg/L)	Số mẫu	Số ngày để hình thành rễ	Số rễ trung bình	Chiều dài rễ trung bình/nuôi cấy (cm)
0.0	10	Không hình thành	0.0	0.0
1.0	10	12-17	2.7	0.93
2.0	10	10-15	4.0	1.20
3.0	10	13-16	3.2	1.10
4.0	10	13-16	2.6	0.98

Dữ liệu trong bảng 3 tiết lộ sự hình thành rễ sớm nhất (10-15 ngày) của rễ mít đạt được trên môi trường ½ MS bổ sung 2mg/L IBA và so sánh với các nghiệm thức khác và bổ sung 4mg/L trên ½ MS cho thời gian tương đối dài hơn (13-17 ngày).
 

3.8 Số rễ trung bình/ mẫu: kết quả trong bảng 3 cho thấy mẫu cây mít nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung 2mg/L IBA cho kết quả cao nhất là 4 rễ/mẫu.
 

3.9 Chiều dài trung bình của rễ (cm): bảng 3 cho kết quả cũng tiết lộ rằng, chiều dài trung bình cao nhất (1.20 cm) của rễ mít đạt được trên môi trường ½ MS bổ sung 2mg/L IBA khi so sánh với các nghiệm thức khác.
 

4 Thảo luận
 

Một số phương pháp nhân giống in vitro đã phát triển, trở nên dễ dàng thực hiện và cho (nguyên văn adopt and achieve) tỉ lệ nhân nhanh cao. Thành công trong vi nhân giống của cây thân gỗ lâu năm rất hạn chế vì các vấn đề nhiễm, sự tiết phenol, thủy tinh thể, cảm ứng rễ, thuần hóa vv. Cây mít là loại cây gỗ lâu năm cho thấy một số đặc tính không mong muốn trên. Trong thí nghiệm này, BAP tại nồng độ 2mg/L cho phản ứng tốt hơn trong tạo chồi, nhân nhanh chồi, kéo dài chồi và số lá trên mẫu. Adiga (1996) thu được kết quả tương tự trên cây mít. Một trăm phần trăm hiệu quả tạo rễ được ghi nhận trên cây mít với IBA và NAA (1mg/L cho mỗi loại) (Amin, 1992).
 

Trên cây mít, 90% tạo rễ đạt được trên môi trường ½ MS bao gồm IBA và IAA (1mg/L cho mỗi loại) (Islam et al, 1993). Trong thí nghiệm này, nồng độ tốt nhất cho tạo chồi là môi trường MS bổ sung 2mg/L BAP và tạo rễ trên môi trường ½ MS bổ sung 2mg/L IBA. Tất cả các nghiệm thức còn lại tạo chồi và rễ ít hơn. Lý do có thể do tình trạng sinh lý của các các mẫu được thực hiện để tạo chồi và rễ khi tương tác với các chất điều hòa tăng trưởng và các yếu tố môi trường. Lý do khác có thể là tế bào thiếu độ nhạy để đáp ứng hình thái học mặc dù có thể có hoặc không có chất điều hòa tăng trưởng trong mức dư thừa hoặc vượt quá.
 

5 Kết luận:
 

Với thí nghiệm này, quy trình cho vi nhân giống A.heterophyllus được hình thành từ chồi đỉnh và sử dụng cho trồng cây mít trong vườn và chương trình tái sinh rừng (reforestation) và mặc khác, nghiên cứu này có thể đánh dấu cho các nghiên cứu chuyển gen và bảo tồn các giống nguy cơ tuyệt chủng ở các nước đang phát triển trong tương lai.

Lời cảm ơn:

Các tác giả vô cùng biết ơn Phòng Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu nông nghiệp Bansladesh (BARI) đã cung cấp cơ sở để thực hiện việc nghiên cứu này.

Tài liệu tham khảo:

Adiga, D.J. (1996) Clonal Propagation of Jackfruit (Artocarpus heterophyllus Lam) cv. Singapore Jack through tissue culture. Current Science, 78, pp. 1231- 1234.

Adiga, T.D., Khan, M.M., and Sathyanarayana, B.N. (1998) Effect of carbon source, culture vessels, gelling agents and GA 3 on in vitro shoot proliferation of Singapore jack (Artocarpus heterophyllus lam.).

Karnataka J. Agric. Sci., 11(3), pp. 632-636 Amin, M.N. (1992) In vitro enhanced proliferation of shoots and regeneration of plants from explants of jack. Plant Tissue Culture, 2, pp. 27-30

Chawla, H.S. (2002) Introduction to plant biotechnology. 2nd ed. New Delhi, Oxford & IBH publishing Co. Pvt. Ltd., pp. 16-17. 

Hazarika, B.N. (2003) Acclimatization of tissue-cultured plants. Current Science, 85 (12), pp. 1704-1712. 

Islam M.S., Sen, J., Alam, N., and Roy, S.K. (1993) Propagation of Jackfruit (Artocarpus heterophyllus) Through Zygotic Embryo Culture In Vitro. Short Communications, Plant Tissue Cult., 3, pp. 51-55.

Morton, J.F. (1987) Jackfruit. In: Jackfruit of warm climates. Miami, Julia, F. Morton, pp. 58-64.

Rajmohan, K., and Mohankumaran, N. (1988) Influence of explant source on the in vitro propagation of jack. Agricultural Research, Journal of Kerala, 26, pp. 69- 174.

Roy, S.K., Royand, P.K., and Brumfield, R.G. (1996) In vitro propagation and establishment of a new cultivar of jackfruit (Artocarpus heterophyllus lam.) bearing fruits twice yearly. Acta Hort., 429, pp. 497-502.

Singh, R., and Tiwari, J.P. (1996) In vitro clonal propagation of jackfruit (Artocarpus heterophylluslam.). J. App. Hort. Nav., 2(1-2), pp. 86-90.

Skoog, F., and Miller, C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultivated in vitro. Symposium Society for Experimental Biology, 11,pp. 118-131.

 

Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com