Cho ra hoa ở hoa hồng giống Rosa indica L. từ các mẫu đốt thân bằng cách thêm AgNO3. Môi trường nuôi cấy là MS và bổ sung các loại hormone như IAA, BA.
Từ khóa: micropropagation, Bạc nitrate, ra hoa invitro, nuôi cấy đốt thân
Tóm tắt: Quá trình ra hoa in vitro ở Rosa indica L. từ các mẫu đốt thân bằng cách bổ sung bạc nitrat đã được thiết lập. Sự hình thành nhân chồi lên đến 5 chồi đạt được trên môi trường MS bổ sung 0.5 mg/L IAA và 1 mg/L BA. Những chồi được tái sinh nuôi cấy trên môi trường MS chứa các nồng độ BA, IAA và sucrose không ra hoa. Số chồi nhân lên đạt được cho thấy các lá vàng dần và được chữa lại bằng cách bổ sung những nồng độ khác nhau của bạc nitrat. Bổ sung bạc nitrat trong môi trường tái sinh cùng với giai đoạn cấy chuyền 3 tuần cảm ứng ra hoa in vitro ở Rosa indica L. Các giai đoạn 3 tuần cho hai lần cấy chuyền liên tiếp trên môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l IAA, 1 mg/l BA và 50 mg/l silver nitrate dưới nhịp độ chiếu sáng 16/8 (chu kỳ sáng/tối) cho hiệu quả trong cảm ứng ra hoa. Các chồi sẵn sàng tạo rễ trên môi trường ¼ MS không có các chất điều hòa tăng trưởng. Các cây con có rễ được thuần dưỡng cứng cáp và trồng trong chậu có mức sống sót 100%.
Giới thiệu:
Hoa hồng là nữ hoàng của các loài hoa. Quần thể hoa hồng như vườn cây cùng với các ứng dụng của chúng trong sản phẩm của hoa cắt cành và như nguồn tinh dầu hoa hồng cho nền công nghiệp mỹ phẩm làm nó thành loài hoa quan trọng nhất. Các giống hoa thường nhân giống sinh dưỡng để duy trì giống thuần. Ở cùng thời gian các hệ thống tái sinh hiệu quả nên được thiết kế để tối thiểu biến dị dòng soma. Các quá trình nhân giống in vitro được thiết lập cho nhiều giống hoa hồng khi dùng đỉnh chồi và các mẫu chồi bất định (1,2). Chúng tôi cũng phát triển hiệu quả để vi nhân giống Rosa indica L. (3). Nhiều nỗ lực thành công để cảm ứng ra hoa in vitro của các loài hoa hồng khác cũng đã được báo cáo (4,5), nhưng ra hoa in vitro chưa được báo cáo trước đó ở Rosa indica L.
Quá trình chuyển đổi từ sự tăng trưởng sinh dưỡng để ra hoa là điểm quan trọng trong sự phát triển cây. Nó được biết đến dưới sự điều khiển của cơ chế chuyển đổi (switch-on mechanism). Cơ sở của cơ chế này được điều chỉnh bởi tổ chức thời gian ra hoa và các gen nhận dạng mô phân sinh với hệ thống thứ bậc phức hợp (6). Cơ chế chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Nó còn thể chịu ảnh hưởng bằng nhiều tác nhân tác động đến sự phát triển của cây (7), bao gồm các hormon (8). Hệ thống in vitro được cân nhắc là công cụ thông dụng để nghiên cứu cơ chế chuyển đổi ra hoa. Thiết lập quy trình in vitro đáng tin cậy để cảm ứng ra hoa ở hoa hồng là quan trọng cho nghiên cứu cơ chế phân tử và dy truyền trong cảm ứng ra hoa và hỗ trợ cho các chương trình chọn tạo giống.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu thực vật
Rosa indica L. được dùng trong thí nghiệm. Các mẫu đốt thân từ các cành tăng trưởng mạnh mẽ của Rosa indica L. và khử trùng bề mặt trong dung dịch 0.1% của thủy ngân clorite trong 12 phút sau đó rửa 3 lần với nước cất vô trùng, mỗi lần 5 phút. Các mẫu đốt thân 0.5 cm được tách cẩn thận từ chồi và nuôi cấy trên môi trường.
Chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ sung auxin kết hợp với cytokine. pH của tất cả môi trường được chỉnh về 5.8 với NaOH 1N và HCl 1N trước khi hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Các ống nghiệm nuôi cấy được để ở 25 ± 2°C với thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày và cường độ ánh sáng là 2500lux và 60% ẩm độ trừ phi có quy định khác.
Các mẫu tái sinh được cấy chuyền thường xuyên trong khoảng thời gian 3 tuần. Các mẫu tái sinh được cấy chuyền sang môi trường mới ¼ MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng. Sau sự phát triển của chiều dài đủ của chồi và rễ, cây con được chuyển sang lọ có nắp vặn chứa vermiculite khử trùng trong 2 tuần để cây cứng cáp.
Xử lý bạc nitrate
Các mẫu cho thấy lá hóa vàng sau lần cấy chuyền đầu tiên. Các nồng độ khác nhau của bạc nitrate (AgNO₃) được bổ sung (10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70 mg/L) cùng với môi trường MS bao gồn hormon (Bảng 1), để cải thiện lá vàng ở Rosa indica L.
Bảng 1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên vàng lá và ra hoa in vitro ở Rosa indica L.
|
MS+hormon (mg/L) |
Nồng độ bạc nitrate (mg/L) |
Lá vàng * |
Ra hoa in vitro * |
IAA – 0.5
BA – 1.0 |
10 |
+ |
- |
|
20 |
+ |
- |
|
30 |
- |
- |
|
40 |
- |
- |
|
50 |
- |
+ |
|
60 |
- |
- |
|
70 |
- |
- |
*Quan sát sau lần cấy chuyền thứ 2 của chu kỳ cấy chuyền 3 tuần (6 mẫu/thí nghiệm)
Kết quả và thảo luận
Các mẫu đốt thân cho thấy sự cảm ứng chồi sau 7 ngày, nhân chồi tối đa quan sát ở các mẫu nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0.5mg/L IAA và 1mg/L BA (Hình 1a&1b). Nhưng các chồi cho thấy các dấu hiệu hình thành hóa vàng từ lần cấy chuyền thứ hai trở đi (Hình 2a), và vấn đề này được chỉnh lại bằng cách bổ sung 30mg/L bạc nitrate trong môi trường MS bổ sung 0.5 g/L IAA và 1 mg/L BA (Hình 2b). Thêm bạc nitrate giảm đáng kể các chồi hóa vàng và tăng mức nhân chồi.
Búp hoa được hình thành từ chồi sau 2 tuần cấy chuyền trên môi trường chứa 50mg/L bạc nitrate (Hình 3a). Phản ứng ra hoa in viro được nghiên cứu dùng các nồng độ bạc nitrate khác nhau trên môi MT tăng thêm 0.5mg/L IAA và 1mg/L BA, nồng độ hormon. Búp hoa đơn được quan sát từ các chồi đơn. Tối đa 5 búp hoa đạt được từ 5 chồi trong nuôi cấy riêng lẻ trên môi trường MS bổ sung 0.5mg/L IAA, 1 mg/L BA và 50mg/L bạc nitrate. Các búp hoa nhỏ được ghi nhận trên môi trường MS tăng cường 50mg/L bạc nitrate cùng 1mg/L IAA và 5mg/L BA. Các búp hoa bắt đầu nở sau lần cấy chuyền thứ 3 trong khoảng thời gian 3 tuần trên môi trường nuôi cấy (Hình 3b). Ra hoa in vitro quan sát được chỉ trên các mẫu bổ sung 50mg/L bạc nitrate (Bảng 1). Ra hoa trong nghiên cứu này được quan sát sau lần cấy chuyền thứ 3 trong thời gian 3 tuần, kết quả tương tự được báo cáp bởi Kanchanapoom trong việc nghiên cứu trước (10), họ cũng báo cáo chu kỳ chiếu sáng không ảnh hưởng lên ra hoa in vitro ở hoa hồng. Tuổi của cây mẹ có thể là một yếu tố khả thi tron quản lý việc cảm ứng ra hoa in vitro (11).
Vi nhân giống chồi từ mẫu đốt thân
Hình 1 (a) Mẫu đốt thân cho thấy sự hình thành chồi trên môi trường MS sau 1 tuần (b) Hình thành nhân chồi trên môi trường MS 0.5 mg/L IAA, 1mg/L BA.
Ảnh hưởng của bạc nitrate lên vàng lá
Hình 2 Cải thiện vàng lá nhờ AgNO3 (a) Trước khi dùng bạc nitrate (b) Lá xanh sau khi dùng bạc nitrate 30mg/L
Hình thành chồi và ra hoa in vitro ở Rosa indica L.
Hình 3 (a) Chồi hoa quan sát sau lần cấy chuyền thứ hai trên môi trường nuôi cấy (b) Ra hoa in vitro của Rosa indica L. trên môi trường MS bổ sung 0.5 mg/L IAA, 1mg/L BA và 50mg/L bạc nitrate
Ra hoa là quá trình phức hợp cho kết quả bởi các yếu tố ngoại và nội sinh và sự hình thành của nó trong nuôi cấy in vitro vô trùng thường ít khi xảy ra. Trong nghiên cứu hiện tại ra hoa được cảm ứng khi có mặt của nồng độ auxin thấp (0.5mg/L IAA) và nồng độ cytokine cao (1mg/L BA) cùng với sự có mặt của nitrate ở dạng muối bạc. Cytokine thúc đẩy sự chuyển đổi cao hơn trong cây đến giai đoạn sinh sản in vitro (12, 13). BA có ứng dụng rộng rãi khi ra hoa in vitro ở nhiều loài hoa hồng (14), và một số loài thực vật khác (15, 16). Các dữ liệu cho thấy cytokine kích thích chuyển đổi cơ chế hình thành hoa trong các điều kiện in vitro.
Khả năng các mẫu hình thành hoa in vitro phụ thuộc vào các yếu tố ngoại sinh, nội sinh, hóa học và vật lý và gần như tất cả các yếu tố này phối hợp trong nhiều phức hợp và nhiều con đường không thể dự đoán trước được (17, 18, 19). Sự kết hợp của các yếu tố dy truyền và môi trường đóng vai trò quan trọng trong phản ứng ra hoa in vitro (20). Ra hoa in vitro được báo cáo ở Ocimitm basilicum trên môi trường ½ MS bổ sung 5 mg/L BA và 1 mg/L IAA. Các kết quả tương tự được báo cáo ở Vitex khi dùng 1.5 mg/L BA kết hợp với 0.1 mg/L NAA (21).
Theo Handro nồng độ auxin thấp cảm ứng ra hoa ở Streptocarpus nobilis (22). Ngược lại trong nghiên cứu hiện tại chỉ một mình auxin không thể cảm ứng ra hoa. Sự thay thế của nitrate trong môi trường MS cho kết quả ra hoa in vitro ở Circhonium intybus (23). Bạc nitrate cảm ứng ra hoa được báo cáo ở Rotida aquatic (24). Các kết quả tương tự đạt được trong nghiên cứu này ở Rosa indica L. Sự bổ sung AgNO₃ trong môi trường với nồng độ thấp của auxin cảm ứng ra hoa in vitro.
Quy trình hiệu quả cho ra hoa in vitro ở Rosa indica L. được phát triển trong nghiên cứu này. Nhiều nghiên cứu hơn nữa cần được điều khiển để đánh giá cơ chế phân tử sau sự ra hoa in vitro bởi bạc nitrate. Quy trình phát triển trong nghiên cứu này sẽ thật sự giúp đẩy nhanh các quy trình chọn giống hoa hồng cho sản xuất của các dòng lai mới lạ, các chế độ nuôi cấy đáng tin cậy hơn cần được làm sáng tỏ trong tương lai.
Lời cảm ơn
Công việc nghiên cứu này được ủng hộ bởi Trường Khoa học Sinh học, Đại học Mahatma Gandhi, Kottayam và Cao đẳng Union Christian, Alwaye, Kerala, India.
Tài liệu tham khảo:
P.T. PRATHEESH*¹ và M. ANIL KUMAR²
*¹School of Biosciences, Mahatma Gandhi University, Kottayam, India.
²Department of Botany, Union Christian College, Alwaye, India.
1. Rout GR, Debata BK and Das P, In vitro mass scale propagation of Rosa hybrida cv. Landora, Current Sci, 5 8: 876- 878, (1989).
2. Skirvin RM , Chu MC and Young HJ, Rose, in Handbook of plant cell culture, Vol V, edited by Ammirato P V, Evans D A, Sharp WR , Bajaj YPS (Mc Graw-Hill Publishing Co. New York).pp 716-743, (1990).
3. Kumar MA and Pratheesh PT, In vitro shoot multiplication in Rosa indica L. Plant Cell Biotech. And Mol. Biol. 5:73-76, (2004).
4. Vu NH, Anh PH, Nhut DT, The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of rose (hybrid tea) cv. ‘First Prize’. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 87:315-320, (2006).
5. Wang GY, Yuan MF, Hong Y, In vitro flower induction in roses. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Plant, 38:513-518, (2002).
6. Nilson O, Weigel D, Modulating the tilling of flowering, Curr Op in Biotechnol, 8 : 195-199, (1997).
7. Chory J, Chattarjee M, Cook RK, Elich T, FankJiauser C, From seed germination to flowering, light controls plant development via pigment phytochrome, in Proc Nail Acad Sci, (USA) 12066-12071.(1996).
8. Bernier G, Havelango A, Houssa C, Petitjean A and Lejeune P, Physiological signals that induce flowering, Plant Cell, 5:147-1150, (1993).
9. Murashige T and Skoog F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant, 15:473-497, (1962).
10. Kanchanapoom K, Posayapisit N and Kanchanapoom K, In vitro flowering from cultured nodal explants of rose (Rosa hybrid L.) Not. Bot. Hort. Cluj, 37(2): 261-263, (2009).
11. Demeulemeester MCA and DeProfit MP, In vivo and in vitro flowering response of chicory (Cichorium intybus L.): influence of plant age and vernalization. Plant Cell reports. 18:781-785, (1999).
12. Paek KY, Shin GB and Kim JJ, Exploitation of temperate Cymbidiiims and establishment of micropropagation system, J Kor Soc Hort Sci, 30: 234-237, (1989) .
13. Wang GY, Xu ZH, Chia TP and Chua NH, In vitro flowering of orchid (Dendrobium candidum) in Biotechnology in Agriculture, edited by B You( Kluwer, Amsterdam) pp 373-378, (1993).
14. Dobres M, Williams L, Gail R, Micropropagation of rose plants. United States patent 5, 843.782, (1998).
15. Lin CS , Lin CC and Chang WC, Effect of thidiazuron on vegetative tissue-derived somatic embryogenesis and flowering of bamboo Bambusa edulis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 76:75-82, (2004).
16. Taylor NJ, Light ME and Van Staden J, In vitro flowering of Kniphofia leucocephala: influences of cytokinins. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 83:327-333, (2005).
17. Tran Than Van M, Direct flower neoformaiion from superficial tissue or small explants of Nicotiana tabaccum L. Planta, 115: 87-92, (1973).
18. Scorza R and Janick J, In vitro flowering of Passiflora suherosa L, J Am Soc Hort Sci,105:127-130, ( 1980).
19. Croes AF, Creemer MT, Vanden Ende G, Kemp A and Barendse G M W, Tissue age as an endogenous factor controlling in vitro bud formation in explants from the inflorescence of Nicotiana tabaccum E, J Exp Biol, 36 :1771-1 779, (1985).
20. Tisserat Band Galletta PD, Production of Cucumber fruits from the culture of “Market more-76” Plantlets. Plant Cell Reports,, 13: 37-40, (1993).
21. Thiruvengadam M and Jayabalan N, In vitro flower ng of Vitex negundo L. a medicinal plant, Plant Cell Biotechnol Mol Biol, 2: 67-70, (2001).
22. Handro W, Effect of some growth regulators on in vitro flowering of Streptococcus nobilis , Plant Cell Rep, 2:133-136. (1983).
23. Bais HP , Sudha G, Ravishankar GA, Influence of putricine, silver nitrate and polyamine on the morphogenetic response in imtransfoniusd and transformed tissue of Circhonium intybus and their regenerants. Plant Cell Rep, 2: 547-555, (2001).
24. Chithra M, Martin KP, Sunandakumari C , Madhusudhanan PV, Silver nitrate induced rooting and flowering in vitro on rare rheophytic woody medicinal plant, Rotula aquatica Lour , J Biotechnol, 3:418-421, (2004).
Có thể bạn quan tâm:
Trâm Anh
SBC Scientific
Hotline: 0945677929
Email: info@sbc-vietnam.com