SBC Scientific - Nuôi cấy mô cây ăn thị Drosera và Dionaea để sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

Nuôi cấy mô cây ăn thị Drosera và Dionaea để sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

Các cây ăn thịt thuộc các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Vì sự phát triển nông nghiệp, quần thể tự nhiên của các cây này bị suy giảm. Giá trị dược liệu và trang trí của các loài này cũng dẫn đến khai thác quá mức. Chi Drosera là nguồn hợp chất dược liệu tự nhiên quan trọng (ví dụ các hợp chất naphthoquinone, flavonoid, anthocyanin, phenolic) dùng như chất nền trong sản xuất dược phẩm.
cay-bat-moi-banner.jpg

Tóm tắt
 

Các cây ăn thịt thuộc các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Vì sự phát triển nông nghiệp, quần thể tự nhiên của các cây này bị suy giảm. Giá trị dược liệu và trang trí của các loài này cũng dẫn đến khai thác quá mức. Chi Drosera là nguồn hợp chất dược liệu tự nhiên quan trọng (ví dụ các hợp chất naphthoquinone, flavonoid, anthocyanin, phenolic) dùng như chất nền trong sản xuất dược phẩm. Droserae herba được sử dụng như tác nhân long đờm, lợi tiểu và chống co thắt. Trong nhiều năm trở lại đây, hoạt tính kháng khuẩn và kháng khối u của chiết xuất Drosera được báo cáo. Cây ăn thịt trở thành cây trang trí quan trọng trong các bộ sưu tập vườn thực vật. Điều này, cũng như mức nhân giống thấp trong môi trường tự nhiên là nguyên nhân để tiến hành nhân giống in vitro cây ăn thịt. Từ một cá thể nuôi cấy nhiều dòng gen in vitro giống nhau thu được thông qua nhân giống vô tính. Kỹ thuật này cho phép tăng hệ số nhân giống cho vật liệu thực vật có giá trị. Thêm vào đó, việc sử dụng chất cảm ứng sinh học và phi sinh học gia tăng các hợp chất có hoạt tính dược liệu (hoạt tính diệt khuẩn, hoạt tính vi khuẩn và hoạt động gây độc tế bào). Các tác nhân đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp. Chúng cảm ứng các phản ứng phòng thủ của thực vật, dẫn đến sự tích lũy các hợp chất thứ cấp. Trong nhiều trường hợp, các hợp chất không sinh tổng hợp bình thường từ thực vật trong môi trường tự nhiên được sản xuất nhờ các tác nhân cảm ứng. Các tác nhận cảm ứng quá trình sinh tổng hợp của các enzyme tham gia vào việc hình thành các hợp chất thứ cấp.
 
Từ khóa: antimicrobial activity, antioxidant, cytotoxic activity, flavonoids, micropropagation, naphthoquinones
 

Giới thiệu
 

Cây ăn thịt là một hiện tượng trong giới thực vật vì chúng lấy dinh dưỡng từ việc bắt mồi. Nhiều nhà thực vật học trước đó đã lưỡng lự để chấp nhận rằng thực vật cũng có khả năng bắt và tiêu hóa côn trùng. Bằng chứng đầu tiên về hội chứng thực vật ăn thịt được Darwin cung cấp vào năm 1875 về "Cây ăn côn trùng". Thuật ngữ ăn côn trùng không hoàn toàn chính xác, vì con mồi của các loài thực vật này không chỉ bao gồm côn trùng và bao gồm các động vật không xương sống lớn hơn, hoặc thậm chí động vật có xương sống.
 
Thuật ngữ "ăn thịt" được đặt cho các cây có thể tiêu hóa mồi bằng các phương pháp bài tiết enzyme. Điều này không bao gồm các loài cây dựa vào hoạt động của vi khuẩn để tiêu hóa. Sự phát triển của sự ăn thịt trong thực vật gắn liền với môi trường mà những thực vật này sinh sống. Đó là một phương tiện để tồn tại trong đất nghèo dinh dưỡng. Các loài thực vật ăn thịt là một nhóm rất đa dạng, với khoảng 600 loài được xác định ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm. Schauler đã chia các loại thực vật này thành 6 bậc gồm 20 chi (Juniper và cộng sự, 1989).
 
Droseracae spp. được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian. Chúng đã được sử dụng trong các trường hợp bệnh phổi và ho (Didry và cs, 1998). Hình thức sử dụng phổ biến nhất ở địa phương hay phân phối trong rượu uống(Caniato và cộng sự, 1989). Bây giờ người ta biết rằng chúng có các tính chất nhờ hai nhóm hợp chất - naphthoquinone và flavonoid. Nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp được sử dụng trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Phần lớn các hợp chất này vẫn thu được từ môi trường sống tự nhiên và ngày càng trở nên khan hiếm. Đây là kết quả của việc khai thác quá mức và sự suy thoái ngày càng tăng của môi trường sống tự nhiên. Sự giảm nhanh các nguồn dược phẩm mới được quan tâm nhiều hơn với các hợp chất được tạo bằng phương pháp in vitro, một phương pháp giảm thiểu ảnh hưởng của sâu bệnh, bệnh tật, khí hậu và sự phụ thuộc vào vị trí địa lý (Burbidge, 1994).
 
Tầm quan trọng của thực vật ăn thịt trong thảo dược
 
Khoảng 50.000 hợp chất hoạt tính sinh học được lấy từ thực vật. Chúng được gọi là các chất chuyển hóa thứ cấp vì chúng không liên quan đến quá trình trao đổi chất cơ bản của cây trồng nhưng được phát triển như là kết quả của các con đường trao đổi chất chuyên biệt (Kohlmünzer, 2003). Thực vật đã là một nguồn hợp chất dược liệu từ thế kỷ thứ 7 TCN. Thuốc thảo dược được mở rộng ở Châu Âu trong thế kỷ 16 và 17. Trong nửa sau của thế kỷ thứ 19, sự quan tâm đến Thuốc thảo dược suy giảm và các loại thảo mộc đã được thay thế bằng dược phẩm tổng hợp. Tuy nhiên, trong thời đại hoá trị liệu, một mối đe dọa mới đã xuất hiện. Số lượng các tác dụng phụ của thuốc đã tăng lên, hơn nữa, không phải tất cả các loại thuốc tổng hợp đều có hiệu quả như các chất tự nhiên. Điều này đã làm gia tăng sự quan tâm đến các thảo dược. Cây dược liệu lại trở thành chủ đề quan tâm của nhiều nhà khoa học và bác sĩ y khoa.
 
Droserae herba là nguồn cyanogen, flavonoid (quercetin, kaempferol), naphtoquinone (plumbagin, ramentaceone) (Bảng 1), enzyme proteolytic, anthocyanin, các hợp chất phenol, axit hữu cơ. Trong những năm gần đây, các hợp chất phenolic từ nuôi cấy in vitro đã được kiểm tra (Budzianowski, 1996; Didry và cộng sự, 1998). Dịch chiết Drosera được báo cáo có chứa 1,4-naphtoquinone, acid ellagic và các dẫn xuất của nó. Trong số các naphtoquinone đã được tìm thấy là các hợp chất hoạt hóa dược, plumbagin và 7-methyljuglone chiếm ưu thế. Các hợp chất này có ở dạng tự do và ở dạng glucoside: 7-methyljuglone 4-O-glucoside (rossoliside) và hydroplumbagin 4-O-glucoside (Pich và Schubert, 1993). Các chế phẩm được sử dụng trong thảo dược có chứa chiết xuất Drosera bao gồm: Drosetux (Dolisos, Dagomed - Pharma), Thymipin (Zyma), Makatussin Forte (Makara), Drosera Complexe Nr 64 (Lehning) và Malia (Dagomed - Pharma).
 
Các hợp chất Naphthoquinone
 
Naphthochinone là các dẫn xuất naptalen. Khu xương naphtoquinon được thay thế ở cacbon C1 và C4 hoặc C1 C2 tương ứng cho naphtoquinone 1,4 hoặc 1,2. Ngoài các cấu trúc monomeric, các cấu trúc dimeric và trimeric cũng được biết đến. Các hợp chất này có màu sắc có thể được nhìn thấy trong phổ ánh sáng, thay đổi từ màu vàng sang màu nâu. Hầu hết các naphtoquinon đều hòa tan trong benzen, chloroform, aceton và rượu.
 
Naphtoquinon như plumbagin, ramentaceone và lapachol có tính chất gây độc. Các hợp chất gây chết tế bào này đã được quan sát ở các dòng tế bào sau: HEPA-3B (Kuo và cộng sự, 1997), HL-60 (Kawiak và cộng sự, 2007), U937, HeLa, MCF-7, HCT-116 (Kawiak và cộng sự, 2011), SKBR3 và BT474 (Kawiak và cộng sự, 2012a; 2012b). Cơ chế hoạt động của chúng dựa trên một số cơ chế như sự liên kết DNA, sự hình thành các dạng ôxy hoạt tính, ngăn ngừa sự bổ sung thymidine vào DNA và chậm tổng hợp acid orotic (Babula và cộng sự, 2009). Nghiên cứu cho thấy rằng naphtoquinone gây chết tế bào trong các dòng tế bào ung thư thông qua các kích hoạt đường dẫn apoptotic. Plumbagin đã được báo cáo để chọn lọc cảm ứng apoptosis trong tế bào ung thư (Ahmad và cộng sự, 2008). Hơn nữa, trong điều kiện in vivo cho thấy plumbagin làm giảm kích thước khối u, 70% những con chuột bị cạo lông được cấy ghép tế bào khối u mà không có phản ứng phụ độc hại (Kuo và cộng sự, 2006).
 
Naphthochinone cũng có tính chất diệt khuẩn và diệt nấm. Didry và cs (1998) báo cáo rằng các chiết xuất chloroform của các bộ phận trên mặt đất của D. peltata thể hiện một loạt các hoạt động chống lại vi khuẩn đường miệng (Streptococcus, Prevotella). Hoạt động này nhờ plumbagin, đó là hợp chất hoạt động chính của chiết xuất. Plumbagin cũng được ghi nhận là có hiệu quả chống lại các vi khuẩn kháng kháng sinh (vi khuẩn phát triển khi có plumbagin không phát triển miễn dịch với streptomycin và rifampicin) (Durga và cộng sự, 1990). Krolicka và cs (2010) xác định giá trị nồng độ diệt khuẩn ít nhất (MBC) sử dụng các chiết xuất từ D. capensis var. Broadleaf và D. muscipula chống lại các mầm bệnh ở người: Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa, cả hai chủng nhạy cảm với kháng sinh và kháng lại. Phạm vi rộng nhất của hoạt tính kháng khuẩn và các ảnh hưởng kháng khuẩn mạnh nhất đã được quan sát thấy trong chiết xuất methanol thu được từ D. muscipula tăng trưởng trên môi trường có hàm lượng nitơ cạn kiệt. Chiết xuất này hoạt động chống lại tất cả các chủng vi khuẩn được kiểm tra (MBC = 25-75 mg tươi trọng lượng / ml). Ferreira và cộng sự (2004) đã kiểm tra các loài Drosera trong tự nhiên ở Braxin chống lại S. aureus, Enterococus faecium, K. pneumonie và Candida albicans. Ba loại chiết xuất từ cây sundew - methanolic, hexane và ethyl acetate đã được kiểm tra cho mỗi vi sinh vật. Sự phát triển của vi sinh vật thay đổi tùy thuộc vào các loài Drosera được sử dụng và loại chiết xuất. Những dữ liệu này cho thấy rõ ràng rằng quinone không phải là các hợp chất hoạt tính vi sinh duy nhất có trong Droseracae. Các nghiên cứu trước đây về mức độ trao đổi chất trong nuôi cấy in vitro của Drosera spp. đã cho thấy cao hơn cây trong in vivo (Crouch và cs, 1990). Lý do cho hiện tượng này không được biết rõ và có thể là do một yếu tố môi trường bị thiếu. Mức độ của quinone trong thực vật liên quan trực tiếp đến môi trường tăng trưởng. Theo nghiên cứu của Ziaratnia và cs (2009), sản phẩm 7-methyljuglone trên môi trường Murashige và Skoog (MS), 1/2 MS hoặc Gamborg B5 được xem xét. Kết quả thấp nhất đối với các môi trường được thử nghiệm đã được trình bày trong các cây trồng phát triển trên môi trường 1/3 MS.
 
Flavonoids
 
Flavonoids là các hợp chất đặc trưng cho cây có hoa. Chúng được tìm thấy phổ biến nhất ở dạng hòa tan trong tế bào nhựa cây. Chúng đóng vai trò trong sắc tố màu vàng, các hợp chất hoạt động sinh học chính trong mô thực vật. Hơn 4.000 thực vật được cô lập và xác định flavonoid (Williams và Grayer, 2004). Tiền chất cho tất cả các flavonoid được biết là chalcone và các dẫn xuất của nó (2N-hydroxychalcone, trihydroxychalcone). Cấu trúc khung xương cơ bản cho nhóm các hợp chất này có 15 nguyên tử cacbon và có thể được mô tả là C6-C3-C6 (hai vòng thơm và cầu 3 carbon được tạo ra qua con đường axit shikimic). Trong hầu hết các trường hợp, vòng phenyl với các nguyên tử cấu tạo thành một cấu trúc giống như 1,4-benzopyrone nên các flavonoid có thể được gọi là các dẫn xuất của chromone.
Flavonoids đóng nhiều vai trò quan trọng trong sinh hóa thực vật. Chức năng cơ bản của chúng là bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa do tính chất chống oxy hóa mạnh và khả năng làm sạch các gốc tự do (Lin và cs, 2002, Vladimirov và cs, 2009). Chức năng thú vị nhất của nhóm hợp chất này là tính chất kháng khuẩn của chúng. Flavonoids, như quercetin và myricetin, giúp chống lại các nhiễm khuẩn có thể xảy ra (Cushnie and Lamb, 2005). Hai thuộc tính này chủ yếu được sử dụng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm (Brand-Garnys et al, 2007). Các chức năng khác bao gồm giúp đỡ các mô chống nhiễm độc kim loại nặng (khả năng chelating - chủ yếu là Fe3+ và Cu2+) (Fernandez và cộng sự, 2002, Mira và cộng sự, 2002), đẩy lùi các loài động vật ăn cỏ và côn trùng (Wang và cộng sự., 2012), chỉ số thụ phấn hoặc thậm chí thu hút vi khuẩn nitơ (nó được biết rằng đậu sử dụng flavonoid như các hợp chất tín hiệu cho vi khuẩn Rhizobium) (Eckardt, 2006).
 
Flavonoids, nhờ cấu trúc đa dạng của chúng, có nhiều tính chất dược lý đã được chứng minh như hoạt tính chống ung thư. Ngoài khả năng quét sạch dạng oxy của phản ứng oxi hóa, chúng cũng có khả năng thay đổi các cơ chế then chốt chịu trách nhiệm cho sự phát triển của khối u ác tính khi chúng hoạt động trong quá trình tắc nghẽn CYP1A và CYP1B1, gây ra các dạng hoạt tính của các chất gây ung thư như hydrocarbon thơm đa vòng (Doostdar và cs, 2000). Ngoài các tính chất này, người ta đã chứng minh rằng flavonoid có trong trà làm tăng hoạt tính enzym chịu trách nhiệm giải độc cơ thể (McKay và Blumberg, 2002). Một tính chất đáng chú ý khác là hoạt động chống viêm, nó tương quan với sự khóa con đường biến đổi acid arachidonic (Ferrandiz và Alcaraz, 1991). Flavonoids là chất ức chế được biết của nhiều enzyme bao gồm thyroperoxidase deiodinase (Ferreira và cộng sự, 2002) và hyaluronidases (Pithayanukul và cộng sự, 2010). Do những tương tác với hệ thống tim mạch, một số flavonoid được sử dụng như là các chất phòng ngừa varice, giãn mạch và xơ vữa động mạch (Vasanthi và cộng sự, 2012). Chúng cũng hoạt động như kháng histamines (Yamamura và cộng sự, 1998) và mô phỏng tính estrogen người (Miksicek, 1993).
Các nghiên cứu của Iwashita và cs (2000) cho thấy quercetin có trong các loài Drosera gây ra apoptosis trong tế bào B16 Melanoma 4A5. Paper và cs (2005) đã thực hiện một xét nghiệm HEX-CAM (xét nghiệm trứng gà - màng nhầy mũi) để kiểm tra hoạt động chống viêm của dịch chiết D. rotundifolia và D. madagascariensis được cho là do hàm lượng flavonoid. Chất chiết xuất ethanol tỏ ra hiệu quả hơn hydrocortisone. Ngoài ra, nó đã được chứng minh rằng chiết xuất methanol từ Drosera aliciae chứa quercitin và myricetin có hoạt động chống oxy hóa mạnh (Krolicka et al, 2009).
 
Sự khai thác chất chuyển hóa thứ cấp từ cây ăn thịt
 
Các dung môi chính được sử dụng để chiết xuất các chất chuyển hóa thứ sinh trong cây ăn thịt là methanol và chloroform. Methanol cho năng suất khai thác tổng thể cao trong khi chloroform có tính chọn lọc cao hơn đối với các hợp chất naphthoquinone. Bước khai thác đầu tiên thường liên quan đến bước ngâm khi có hoặc không có sử dụng nitrogen lỏng để thấm mô. Vật liệu khô và tươi được sử dụng cho quá trình này nhưng sản sinh chất chuyển hóa thứ sinh cho vật liệu tươi cao hơn nhiều (Marczak và cộng sự, 2005). Các kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất là ngâm khí đơn giản, tăng cường siêu âm và chiết Soxhlet. Kołodziejski (2010) so sánh các phương pháp chiết xuất khác nhau, đó là chiết xuất Soxhlet, đồng nhất, chiết xuất siêu âm, ngâm và tăng cường vi sóng chiết xuất với việc sử dụng methanol làm dung môi chính. Năng suất cao nhất ở naphtoquinones và flavonoid thu được bằng cách ngâm lâu và siêu âm tan rã. Grevenstuk và cs (2012) trình bày cách tiếp cận khác nhau bằng cách sử dụng chiết xuất CO2 siêu tới hạn và n-hexane có tính chọn lọc hơn đối với naphtoquinones. Nghiên cứu của họ đã chứng minh rằng việc chiết xuất bằng phương pháp siêu âm giúp cho sản lượng plumbagin cao nhất vượt qua sự khai thác chất lỏng siêu tới hạn, có thể là do sự phức tạp của chất nền mẫu. Trong công trình của Marczak và cs (2005), methanol và chloroform đã được thử nghiệm như dung môi để thu được quinone. Chloroform được chứng minh là một dung môi tốt hơn nhưng nó cũng đã nói rằng một số hợp chất chiết xuất tốt hơn từ thực vật với việc sử dụng methanol. Kämäräinen và cs (2003) đã sử dụng toluene làm dung môi chiết.
 
Nhân giống in vitro cây ăn thịt
 
Cây ăn thịt là một hiện tượng trong giới thực vật và là cây có giá trị làm cảnh. Chúng bắt con mồi bằng các thiết bị bẫy chuyên dụng, là một cách bổ sung để có được protein - một nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển thích hợp của tất cả các sinh vật (Williams, 1982). Cây ăn thịt đã trở thành cây trang trí quan trọng trong bộ sưu tập vườn thực vật. Thực tế, tỷ lệ nhân giống thấp của các loại thực vật này trong môi trường tự nhiên là lý do để nhân giống in vitro cây ăn thịt.
 
Từ một cây duy nhất được nuôi cấy in vitro các dòng vô tính giống hệt nhau về mặt di truyền có thể thu được thông qua nhân giống sinh dưỡng. Kỹ thuật này cho phép tăng tỷ lệ nhân giống của vật liệu thực vật có giá trị. Vi nhân giống là một phương pháp nhân giống cây cảnh (Orchidaceae, Rosaceae), các loài quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng (Orchidaceae, Rubus) cũng như các loại thực vật chuyển hóa thứ cấp (Lithospermum erythrorhizon, Panax ginseng, Echinacea purpurea, Curcuma longa).
 
Công việc liên quan đến nuôi cấy in vitro của loài thực vật ăn thịt đã được thực hiện trong các phòng thí nghiệm khác nhau ở Ba Lan. Nghiên cứu đầu tiên được thực hiện trong Vườn Bách thảo ở Wrocław liên quan đến các loài như: Dionaea muscipula (Kukułczanka và cs 1989), Drosophyllum lusitanicum (Kukułczanka và Cząstka, 1991), Drosera intermedia L., Drosera rotundifolia L., Drosera spathulata L. (Kukułczanka và cs, 1991) và Drosera bredifolia Pursh (Kukułczanka và Cząstka, 1987). Những loài này được trồng trên môi trường Reinert và Mohr (RM) và Murashige và Skoog (MS). Janssens (1986) báo cáo vi nhân giống của Drosera regia trên môi trường MS với thành phần vitamin cải tiến. Sự vi nhân giống của Dionaea muscipulahas thường được báo cáo (Garnett 1982; Bruce và cộng sự, 1982; Minocha, 1985; Królicka và cộng sự, 2008).
 
Nghiên cứu được thực hiện trong Phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và công nghệ sinh học của Khoa Công nghệ sinh học liên trường ở Gdańsk, Ba Lan, đã cho phép xác định môi trường tối ưu và điều kiện nuôi cấy in vitro cho các loài cây ăn thịt sau (Hình 1): Drosera ramentaceae, Drosera anglica , Drosera binata, Drosera cuneifolia, Dionaea muscipula, Drosera capensis (Kawiak, 2002; Kawiak và cộng sự, 2003; Krolicka và cộng sự, 2008), Drosera aliciae (Krolicka và cộng sự, 2008, Kawiak và cộng sự, 2011), Drosera adelae (Kawiak và cs, 2002) và Drosera gigantea (Taraszkiewicz và cộng sự, 2012). Các môi trường rắn và lỏng khác nhau đã được thử nghiệm: MS và 1/2 MS, RM, Lindemann, Vacin và Went và Fast (Hình 2). Các môi trường cơ bản được bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng ở nồng độ khác nhau bao gồm auxin: 2,4 axit dichlorophenoxyacetic (2,4-D), naphthylaceticacid (NAA), axit indoleacetic (IAA) và cytokinin: kinetin (KIN), 6-benzylaminopurine (BAP), zeatin (Z) và gibberellin (GA3). Các môi trường tối ưu cho nhân giống in vitro của cây trồng từ chi Drosera và Dionaea được chứng minh là môi trường 1/2 MS và RM. Để có được tỷ lệ nhân giống cao, lá được cắt thành các mẫu và đặt trên môi trường bổ sung các chất điều chỉnh tăng trưởng. Sau khoảng thời gian 6-8 tuần, trung bình từ 3 đến 12 cây được thu được từ một mẫu. Người ta ước tính có thể thu được từ 100 đến 300 cây trong vòng một năm. Sau 16-20 tuần, tỷ lệ gia tăng thu được cho các loài khác biệt - Drosera anglica (1:8), Drosera binata (1:12) và Drosera cuneifolia (1:6) (Kawiak, 2002; Kawiak và cộng sự, 2003) ). Hình 1 cho thấy sự tăng trưởng thu được trong nuôi cấy in vitro của D. anglica, D. binataand D. cuneifolia trên các môi trường khác nhau (Kawiak, 2002).
 
Như có thể thấy từ các dữ liệu được trình bày ở trên, không thể chọn môi trường lý tưởng cho tất cả các loài Drosera. Nếu một môi trường phải được lựa chọn để phù hợp với nghiên cứu này thì môi trường ½ MS sẽ mang lại kết quả tổng thể tốt nhất. Trong một nghiên cứu của Jang và cs (2003), sự gia tăng chồi tùy thuộc vào nồng độ khác nhau của các chất đa lượng trong môi trường MS đã được thử nghiệm. Kết quả tốt nhất thu được ở môi trường 1/3 MS và thấp nhất ở môi trường 1/9 MS. Theo nghiên cứu của Grevenstuk và cs (2010), môi trường tăng trưởng tốt nhất cho D. intermedia được tìm thấy là 1/4 MS. Ngoài ra, trong cùng một nghiên cứu đã được chứng minh rằng việc bổ sung kinetin không làm tăng sinh trưởng ở thực vật. Một quan sát tương tự đã được thực hiện bởi Jayaram và Prasad (2005), người phát hiện ra rằng cytokinin nồng độ cao làm chậm sự tăng trưởng của Drosera indica và Drosera burmanii. Trong bài báo của Hook (2001), sự khác biệt về tăng trưởng trên môi trường rắn và lỏng đã được thử nghiệm. D. muscipula không phát triển trong môi trường lỏng trong khi Drosera sp. tăng trưởng tốt trên một trong các môi trường được thử nghiệm. Hơn nữa, pH của môi trường tăng trưởng đóng một vai trò quan trọng. Trong nghiên cứu được trình bày ở trên, độ pH 5,5 được sử dụng. Trong các nghiên cứu được công bố trước đây, pH tối ưu dao động từ 5,5 đến 5,8. Jayaram và Prasad (2006) nói rằng D. indica sống trong phạm vi rộng của pH nhưng độ pH tối ưu cho rễ là 5,7.
 
Cảm ứng các chất chuyển hóa thứ cấp
 
Chất cảm ứng đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp (Verpoorte và cs, 1999). Chúng tạo ra phản ứng phòng vệ ở thực vật, dẫn đến sự tích lũy các chất chuyển hóa thứ cấp. Trong một số trường hợp, các hợp chất không được tổng hợp bình thường bởi các thực vật trong môi trường tự nhiên được tạo ra khi bị có sự cảm ứng. Các chất gây cảm ứng tạo ra các enzym sinh tổng hợp tham gia vào quá trình sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp (Hahlbrock và cs, 1981; Hilton và Rhodes, 1993; Burbidge, 1994).
 
Đã có chứng minh cho thấy các loài ăn thịt dễ bị cảm ứng in vitro. Do hiện tượng này nên có thể tăng cường sản xuất naphthoquinones có giá trị (Królicka và cộng sự, 2008). Các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất trong mô thực vật như là kết quả của sự tương tác giữa tác nhân bệnh và thực vật. Đây là cơ chế phòng ngừa nhiễm trùng. Việc bổ sung một phần của thành tế bào mầm bệnh gây ra phản ứng phòng thủ và kết quả là quá trình tổng hợp naphthoquinone xảy ra (Juniper và cs 1989). Putalun và cs (2010) nghiên cứu ảnh hưởng của methyl jasmonate, chiết xuất men và chitosan. Trong nghiên cứu của họ, chiết xuất nấm men đã được tìm thấy để tăng cường sản xuất plumbagin trong rễ của D. burmaniiby gấp 3,5 lần so với cây đối chứng. Krolicka và cs (2008) đã chứng minh rằng sử dụng các chất sau đây: dịch khuẩn hấp khử trùng của Agrobacterium rhizogenes, tác nhân thô Verticillium dahliae, axit jasmonic hoặc nồng độ nitơ thấp hơn, sản xuất naphthoquinones, ramentaceone và plumbagin, được tăng lên trong tăng trưởng in vitro Drosera capensis var. Broadleaf và nuôi cấy D. muscipula. Hơn nữa, L-phenylalanine và acid trans-cinnamic (tiền chất của con đường shikimate) được sử dụng để tăng sản xuất flavonoid (quercetin và myricetin).
 
Một phương pháp khác được sử dụng để tăng mức độ các chất chuyển hóa thứ cấp sử dụng trong nuôi cấy in vitro ở cây ăn thịt là biến đổi thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes. Đây là một vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí thuộc chi Agrobacterium (Rhizobiaceae). Độc lực của vi khuẩn này là do sự hiện diện của plasmid Ri với một đoạn T-DNA (chuyển DNA) có chứa các chất gây mô sẹo được chuyển tới tế bào thực vật trong quá trình lây nhiễm (Singleton, 1999). Trong các báo cáo, chỉ có một báo cáo về việc biến đổi cây ăn thịt với A. rhizogenes (Królicka và cs, 2010). Hirsikorpi và cs (2002) đã phát triển một phương pháp biến đổi cho D.rotundifolia sử dụng một dòng cải biến của A. tumefaciens thu được 17% hiệu quả của quá trình. Các vấn đề trong nuôi cấy rễ cây ăn thịt là không phải tất cả các cây đều dễ bị biến đổi (Porter, 1991). Drosera sp. đã nghiên cứu sở hữu nhiều chất chuyển hóa thứ cấp kháng khuẩn mà cũng có thể tạo ra hoạt chất chống lại Agrobacterium (Królicka và cộng sự, 2010).
 

Kết luận
 

Cây ăn thịt là nguồn các chất chuyển hóa thứ cấp tiềm năng. Các nghiên cứu về tính chất sinh hóa các hợp chất của chúng vẫn đang được tiến hành, đóng góp dữ liệu mới mỗi năm. Bởi vì thu hoạch quá mức, các loài Drosera trong tình trạng nguy cấp. Điều này đã bảo đảm sự phát triển của các phương pháp nhân giống in vitro chuẩn hóa để bảo tồn chúng. Những nghiên cứu này đã cung cấp các phương tiện để tiếp tục nghiên cứu về những cây này. Hơn nữa, phương pháp nhân giống in vitro cung cấp phương tiện để tăng mức độ các chất chuyển hóa thứ cấp thông qua sự cảm ứng hoặc thay đổi di truyền.
 

Lời cảm ơn
 

Công trình này được hỗ trợ bởi trợ cấp của Bộ  Khoa học và Giáo dục Đại học số. 3021/B/P01/2009/36.
Bảng 1. Danh sách các naphtoquinone cơ bản và tính chất hóa học
bang-1-nuoi-cay-mo-cay-bat-moi.png

hinh-1-nuoi-cay-mo-cay-bat-moi.png
Hình 1. Bộ sưu tập các cây ăn thịt ở PTN Bảo tồn thực vật và Công nghệ sinh học
Khoa Công nghệ sinh học liên hợp, UG & MUG
nuoi-cay-mo-cay-bat-moi.png
Hình 2. Sự tăng trưởng của Drosera anglica, Drosera binata và Drosera cuneifolia phụ thuộc vào loại môi trường
 

Tài liệu tham khảo
 

Ahmad A., Banerjee S., Wang Z., Kong D., Sarkar F.H. (2008) Plumbagin-induced apoptosis of human breast cancer cells is mediated by inactivation of NF-kappaB and Bcl-2.J. Cell. Biochem. 105(6): 1461-1471.
Babula P., Adam V., Havel L., Kizek R. (2009) Noteworthy secondary metabolites naphthoquinones – their occurrence, pharmacological properties and analysis. Curr. Pharmaceut. Anal. 5(1): 47-68.
Brand-Garnys E.E., Denzer H., Meijer H., Brand H.M. (2007) Flavonoids: A review for cosmetic application. part two. J. App. Cosmetol. 25(4): 145-159.
Bruce J., Philip T., Earlene A. (1982) Tissue culture of single rhizome explants of Dionaea muscipula for rapid asexual propagation.J. Amer. Soc. Hort. Sci. 107: 305-310.
Budzianowski J. (1996) Naphthohydroquinone glucosides of Drosera rotundifolia and D. intermedia from in vitro cultures. Phytochemistry 42(4): 1145-1147. 
Burbidge A. (1994) Secondary plant metabolites from tissue culture. In: In vitrocultivation of plant cells. Ed. Hunter C. F. Butterworth Heinemann, 131-151.
Caniato R., Filippini R., Cappelletti E.M. (1989) Naphthoquinone contents of cultivateddrosera species Drosera binata, D. binata var. dichotoma, and D. capensis. Intern. J. Crude Drug Res. 27(3): 129-136.
Crouch I.J., Finnie J.F., van Staden J. (1990) Studies on the isolation of plumbagin fromin vitro and in vivo grown Drosera species. Plant Cell Tissue Organ Cult. 21(1): 79-82.
Cushnie T.P.T., Lamb A.J. (2005) Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents 26(5): 343-356.
Didry N., Dubreuil L., Trotin F., Pinkas M. (1998) Antimicrobial activity of aerial parts of Drosera peltata smith on oral bacteria. J. Ethnopharmacol. 60(1): 91-96.
Doostdar H., Burke M.D., Mayer R.T. (2000) Bioflavonoids: Selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1A and CYP1B1. Toxicology 144(1-3): 31-38.
Durga, R., Sridhar, P., Polasa, H. (1990) Effects of plumbagin on antibiotic resistance in bacteria. Indian J. Med. Res. A 91: 18-20.
Eckardt N.A. (2006) The role of flavonoids in root nodule development and auxin transport in Medicago truncatula. Plant Cell 18(7): 1539-1540.
Fast G. (1981) Orchideenkultur. E. Ulmer, Stuttgart. Fernandez M.T., Mira M.L., Florêncio M.H., Jennings K.R. (2002) Iron and copper chelation by flavonoids: An electrospray mass spectrometry study. J. Inorg. Biochem.92(2): 105-111.
Ferrandiz M.L., Alcaraz M.J. (1991) Anti-inflammatory activity and inhibition of arachidonic acid metabolism by flavonoids. Agents Actions 32(3-4): 283-255.
Ferreira A.C.F., Lisboa P.C., Oliveira K.J., Lima L.P., Barros I.A., Carvalho D.P. (2002) Inhibition of thyroid type 1 deiodinase activity by flavonoids.  Food Chem. Toxicol. 40(7): 913-917.
Ferreira D.T., Andrei C.C., Saridakis H.O., De Jesus Faria T., Vinhato E., Carvalho K.E., Braz-Filho R. (2004) Antimicrobial activity and chemical investigation of Brazilian Drosera. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 99(7): 753-755.
Garnett K. (1982) Cultivation and propagation of insectivorous plants. Plant Propagators Soc. 31: 16-324.
Grevenstuk T., Coelho N., Gonçalves S., Romano A. (2010) In vitro propagation of Drosera intermedia in a single step. Biol. Plantarum 54(2): 391-394.
Grevenstuk T., Gonçalves S., Nogueira J.M.F., Bernardo-Gil M.G., Romano A. (2012) Recovery of high purity plumbagin from Drosera intermedia. Industrial Crops Prod.35(1): 257-260.
Hahlbrock K., Lamb C.J., Purwin C., Ebel J., Fautz E., Schafer E. (1981) Rapid response of suspension-cultured parsley cells to the elicitor from Phytophthora megasperma var. sojae. Plant Physiol. 67: 768-773.
Hilton M.G., Rhodes M.J.C. (1993) Factors affecting the growth and hyoscyamine production during batch culture of transformed roots of Datura stramonium. Planta Med. 59(4): 340-344.
Hirsikorpi M., Kämäräinen T., Teeri T., Hohtola A. (2002) Agrobacterium-mediated transformation of round leaved sundew (Drosera rotundifolia L.). Plant Sci. 162(4): 537-542.
Hook I.L.I. (2001)Naphthoquinone contents of in vitro cultured plants and cell suspensions of Dionaea muscipula and Drosera species. Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 67(3):281-285.
Iwashita K., Kobori M., Yamaki K., Tsushida T. (2000) Flavonoids inhibit cell growth and induce apoptosis in B16 melanoma 4A5 cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(9): 1813-1820.
Jang G., Kim K., Park R. (2003) Micropropagation of venus fly trap by shoot culture. Plant Cell Tiss. Organ Cult.72(1): 95-98.
Janssens J. (1986) In vitro propagation of sundew, Drosera regia Stephens. Mededelingen van de Faculteit Landbouwwetensschappen, Rijksuniversiteit Gent 51: 61-66.
Jayaram K., Prasad M.N.V. (2005) Rapidly in vitro multiplied drosera as reliable source for plumbagin bioprospection. Curr. Sci. 89(3): 447-448.
Jayaram K., Prasad M.N.V. (2006) Drosera indica L. and D. burmanii vahl., medicinally important insectivorous plants in andhra pradesh – regional threats and conservation. Curr. Sci. 91(7): 943-946.
Juniper B.E., Robins R.J., Joel D.M. (1989) The carnivorous plants. Academic Press, London.
Kämäräinen T., Uusitalo J., Jalonen J., Laine K., Hohtola A. (2003) Regional and habitat differences in 7-methyljuglone content of Finnish Drosera rotundifolia.  Phytochemistry 63(3), 309-314.
Kawiak A. (2002) Zastosowanie kultur in vitro do mikropropagacji roślin owadożernych i produkcji cennych metabolitów wtórnych. Master Thesis, University of Gdańsk.
Kawiak A., Królicka A., Łojkowska E. (2002) Micropropagation of carnivorous plants for the production of secondary metabolites from the group of naphthoquinones. 29 th Ann. Conf. of the Jagiellonian University “Progress in molecular biology”, Kraków, Poland, 37.
Kawiak A., Królicka A., Lojkowska E. (2003) Direct regeneration of Drosera from leaf explants and shoot tips. Plant Cell Tiss Organ Cult. 75(2): 175-178.
Kawiak A., Królicka A., Łojkowska E. (2011) In vitro cultures of Drosera aliciae as a source of a cytotoxic naphthoquinone: ramentaceone. Biotechnol. Lett. 33(11): 2309-2316.
Kawiak A., Piosik J., Stasilojc G., Gwizdek-Wisniewska A., Marczak L., Stobiecki M., Lojkowska E. (2007) Induction of apoptosis by plumbagin through reactive oxygen species-mediated inhibition of topoisomerase II. Toxicol.Appl. Pharmacol. 223(3): 267-276.
Kawiak A., Zawacka-Pankau J., Wasilewska A., Stasilojc G., Bigda J., Lojkowska E. (2012a) Induction of apoptosis in HL-60 cells through the ROS-mediated mitochondrial pathway by ramentaceone from Drosera aliciae. J. Nat. Prod.75(1): 9-14.
Kawiak A., Zawacka-Pankau J., Lojkowska E. (2012b) Plumbagin induces apoptosis in Her2-overexpressing breast cancer cells through the mitochondrial-mediated pathway. J. Nat. Prod. 75(4): 747-751.
Kohlmünzer S. (2003) Farmakognozja. Podręcznik dla studentów farmacji. PZWL, Warszawa.
Kołodziejski D. (2010)Porównanie efektywności wybranychtechnik ekstrakcji/ługowania metabolitów wtórnych z suchego materiału roślin owadożernych. Master Thesis, Gdańsk University of Technology.
Krolicka A., Szpitter A., Gilgenast E., Romanik G., Kaminski M., Lojkowska E. (2008) Stimulation of antibacterial naphthoquinones and flavonoids accumulation in carnivorous plants grown in vitro by addition of elicitors. Enzyme Microbial. Technol. 42(3): 216-221.
Krolicka A., Szpitter A., MaciagM., Biskup E., Gilgenast E., Romanik G., Kaminski M., Wegrzyn G., Lojkowska E. (2009) Antibacterial and antioxidant activity of the secondary metabolites from in vitro cultures of Drosera aliciae.Biotechnol. Appl. Biochem. 53(3): 175-184.
Krolicka A., Szpitter A., Stawujak K., Baranski R., GwizdekWisniewska A., Skrzypczak A., Kaminski M., Lojkowska E. (2010) Teratomas of Drosera capensis var. alba as a source of naphthoquinone: ramentaceone. Plant Cell Tiss.Organ. Cult. 103: 285 - 292.
Kukułczanka K., Cząstka B. (1987) Rozmnażanie rosiczek (Drosera L.) w warunkach in vitro. Wiad. Bot. 31(2): 61-64.
Kukułczanka K., Cząstka B. (1991) Rozmnażanie wybranych gatunków Droseraceae i utworzenie banku genów w kulturze in vitro. Prace Ogrodu Botanicznego PAN (1): 55-61.
Kukułczanka K, Kromer K, Klonowska B, Cząstka B (1991). Wpływ temperatury na przechowywanie kultur roślin Droseraceae in vitro. Prace Ogrodu Botanicznego PAN 1: 63-68.
Kukułczanka K., Cząstka B., Arczewska A. (1989) Regeneration from leaves of Dionaea muscipula Ellis cultured in vitro.Acta Hort., Third Symposium on Growth Regulators in Ornamental Horticulture, 5-10 September 1988, Skierniewice, Poland, 251: 155-160.
Kuo P.L., Hsu Y.L., Cho C.Y. (2006) Plumbagin induces G2-M arrest and autophagy by inhibiting the AKT/mammaliantarget of rapamycin pathway in breast cancer cells.Mol. Cancer Ther. 5(12): 3209-3221.
Kuo Y.H., Chang C.I., Li S.Y., Chou C.J., Chen C.F., Kuo Y.H.,Lee K.H. (1997) Cytotoxic constituents from the stems of Diospyros maritima. Planta Med. 63(4): 363-365.
Lin C., Chen C., Lee H., Lin J. (2002) Prevention of cellular ROS damage by isovitexin and related flavonoids. Planta Med. 68(4): 365-367.
Lindemann E.G.P., Gunckel J.E., Davidson O.W. (1970) Meristem culture of Cattleya. Am. Orchid Soc. Bull. 39: 100-127.
Marczak Ł., Kawiak A., Łojkowska E., Stobiecki M. (2005) Secondary metabolites in in vitro cultured plants of the genus Drosera. Phytochem. Anal. 16(3): 143-149.
McKay D.L., Blumberg J.B. (2002) The role of tea in human health: An update. J. Am. Coll. Nutrit. 21(1): 1-13.
Miksicek R.J. (1993) Commonly occurring plant flavonoids have estrogenic activity. Mol. Pharmacol. 44(1): 37-43.
Minocha S.C. (1985) In vitro propagation of Dionaea muscipula. HortSci. 20: 216-217.
Mira L., Fernandez M.T., Santos M., Rocha R., Florêncio M.H., Jennings K.R. (2002) Interactions of flavonoids with iron and copper ions: A mechanism for their antioxidant activity. Free Radical Res. 36(11): 1199-1208.
Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.
Paper D.H., Karall E., Kremser M., Krenn L. (2005) Comparison of the antiinflammatory effects of Drosera rotundifolia and Drosera madagascariensis in the HEX-CAM assay. Phytother. Res. 19(4): 323-326.
Pich U., Schubert I. (1993) Midiprep method for isolation of DNA from plants with a high content of polyphenolics. Nucl. Acids Res. 21(14): 3328.
Pithayanukul P., Leanpolchareanchai J., Bavovada R. (2010) Inhibitory effect of tea polyphenols on local tissue damage induced by snake venoms. Phytother. Res. 24(suppl. 1): S56-S62.
Porter J.R. (1991) Host range and implications of plant infection by Agrobacterium rhizogenes.Critical Rev. Plant Sci. 10: 387-421.
Putalun W., Udomsin O., Yusakul G., Juengwatanatrakul T., Sakamoto S., Tanaka, H. (2010) Enhanced plumbagin production from in vitro cultures of Drosera burmanii using elicitation. Biotechnol. Lett. 32(5): 721-724.
Reinert R.A., Mohr H.C. (1967) Propagation of Cattleya by tissue cultures of lateral bud meristems. Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 91: 664-671.
Singleton P. (1999) Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, transl. Markiewicz Z., PWN, Warszawa.
Taraszkiewicz A., Jafra S., Skrzypczak A., Kaminski M., Krolicka A. (2012) Antibacterial activity of secondary metabolites from in vitro culture of Drosera gigantea against plant patogen Pseudomonas syringae pv. syringae and P. syringae pv. morsprunorum. J. Plant Pathol. 94 (1, suppl):63-68.
Vacin E.F., Went F.W. (1949) Some pH changes in nutrient solutions. Bot. Gaz. 110: 605-613.
Vasanthi H.R., ShriShriMal N., Das D.K. (2012) Phytochemicals from plants to combat cardiovascular disease. Curr.Med. Chem. 19(14): 2242-2251.
Verpoorte R., Van Der Hejden R., Ten Hoopen H.J.G., Memelink J. (1999) Metabolic engineering of plant secondary metabolite pathways for the production of fine chemicals. Biotechnol. Lett. 21(6): 467-479.
Vladimirov Y.A., Proskurnina E.V., Demin E.M., Matveeva N.S., Lubitskiy O.B., Novikov A.A., Kagan V.E. (2009) Dihydroquercetin (taxifolin) and other flavonoids as inhibitors of free radical formation at key stages of apoptosis.Biochem. (Moscow), 74(3): 301-307.
Wang Y., Siemann E., Wheeler G.S., Zhu L., Gu X., Ding J. (2012)Genetic variation in anti-herbivore chemical defences in an invasive plant. J. Ecology 100: 894-904.
Williams C.A., Grayer R.J. (2004) Anthocyanins and other flavonoids. Nat. Prod. Rep. 21(4): 539-573.
Williams S.E., Bennet A.B. (1982) Leaf closure in the Venus flytrap: an acid growth response. Science 218: 1120-1121.
Yamamura S., Ozawa K., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K. (1998) Antihistaminic flavones and aliphatic glycosides from Mentha spicata. Phytochemistry 48(1): 131-136.
Ziaratnia S.M., Kunert K.J., Lall N. (2009) Elicitation of 7-methyljuglone in Drosera capensis. South Afr. J. Bot. 75(1): 97-103.

Trâm Anh
SBC Scientific
 

Nhà phân phối